《组织化学技术教程》PPT课件

《《组织化学技术教程》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第四章普通组织化学普通组织化学是指以常用的组织化学技术，对细胞内主要化学成分和活性的粗略（一般性）的研究。本章就几个经典实验概要介绍如下：一、核酸（DNA和RNA）（一）化学特性1．分布：DNA（细胞核内）RNA（核仁10%；细胞质-核糖体90%）2．分子结构：戊糖+磷酸+碱基特点：①大量的磷酸基团→酸性（嗜碱性的基础）②戊糖—被盐酸水解→醛基（成为Feulgen法显示核酸的基础）②戊糖—被盐酸水解→醛基（成为Feulgen法显示核酸的基础）③可以完全水解或部分水解④可以用RNAase或DNAase消化[对照实验（—）]（一）显示方法1．

2、福尔根（Feulgen）反应显示DNA[原理]在60℃温度下，将DNA用1N盐酸水解，DNA双链打开成单链，先释出碱基，然后脱氧核糖释出醛基，该醛基与Schiff氏液形成紫红色沉淀。[Schiff试剂显色原理]碱性品红亚硫酸→白亚黄酸（无色试剂，称为Schiff试剂）[方法]固定剂的选择可用一般的组织学固定液，常用Carnoy固定液。Carnoy固定液：纯酒：氯仿：冰醋酸=6：3：1(60ml)(30ml)(10ml)恒冷箱切片机的具体染色步骤如下：⑴切片固定在冰醋酸与纯乙醇（1：3V/V）中10分钟。⑵由乙醇降至蒸馏水中。⑶用1N盐酸浸

3、泡。⑷放入预热到60℃的1N盐酸中，留6分钟。⑸放入室温的1N盐酸中。⑹放入Schiff液试剂，保持在暗处，60分钟⑺用新配制的SO2水浸洗3次（脱掉未反应的Schiff液）。⑻蒸馏水浸洗净（必须用蒸馏水→洗净无色品红，否则，残留试剂→有色品红）。⑼脱水透明、封固。结果：核内DNA染为红紫色。对照：仅改变第4步为1N盐酸，室温15分钟→（-）。[注意事项]⑴不用醛类固定剂如Bouin、戊二醛、丙烯醛等。常用Carnoy液、甲醇等。⑵控制水解时间，不同的固定剂用不同的时间，如：Carnoy8分钟；Genker5分钟；Susa18分钟★最适条

4、件应自行试验。⑶控制温度，一般1N盐酸60℃；如果5N盐酸18～25度。⑷保证Schiff试剂的纯净度。⑸SO2要新配制，除去多余的Schiff液宜用之。⑹必须对照。2．显示核酸的其它方法⑴Kurnick甲绿Methylgreen显示DNA法⑵甲绿派若宁Methygreen-Pyronin显示DNA和RNA法⑶菊花青铬明矾（GC）显示核酸法⑷丫啶橙AcridineOrange显示DNA和RNA法⑸核酸提取法一、蛋白质（Protein）（一）蛋白质的分子结构蛋白质的基本单位是氨基酸，肽键将不同的氨基酸结合在一起，除氨基和羧基之外，还含有其它

5、基团，如：—羟基、硫氢基、二硫基等。依其结构特点可分为：酸性氨基酸和碱性氨基酸；芳香族氨基酸：苯丙氨基酸、酪氨基酸；杂环类氨基酸：组氨基酸、色氨基酸、亚氨基酸、脯氨基酸、羟脯氨基酸。（二）目前应用1．用于蛋白质的一般定性①确定是否为蛋白质②确定蛋白质的酸碱性③显示蛋白质的特殊基团2．用于蛋白质功能定性和定位（三）染色方法目前，研究蛋白质功能定性和定位时多用酶组织化学法、配体—受体结合法、免疫组化法以显示特殊的蛋白质。这里仅介绍一般的染色方法。1．四氮化联邻茴香胺法（Tetra-azotized-o-anisidine）[应用]广泛应用于显

6、示酶的活性[原理]芳香伯胺与亚硝酸作用，在低温下（＜5℃）可生成重氮盐，此即重氮反应。重氮盐可与酚类作用生成有色化合物——偶氮化合物。上述反应必须在酸性条件下进行。本实验，联邻茴香胺在酸性、低温条件下与亚硝酸作用生成四氮盐。四氮盐有两个重氮盐，其中一个重氮基在碱性条件下与所要显示的组氨酸、色氨酸及酪氨酸的苯环结合产生偶联反应，另一个重氮基与酚类或奈类发生偶联反应以增色。因此，可以用生成的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量。[方法]1．四氮盐配制⑴天平称取联邻茴香胺0.25g（有毒，通风橱内进行）。⑵在冰浴下，加入已预冷8%盐酸10ml，玻

7、璃搅拌，促其溶解，混合后为悬浊液。⑶称NaNO20.15g溶于1ml蒸馏水中（冰浴下）。⑷在冰浴下，将配好的NaNO2溶液分三次倒入邻联茴香胺悬浊液内，每次倒入都须玻棒搅动，因产生NO2可有黄烟冒出，至黄烟停止再倒下一次液体。放入冰箱（4℃）内，约20分钟，待溶液变为黄色。⑸倾出上清液，勿将沉渣泛起，弃去沉渣。⑹用NaHCO3细粉（约0.5～0.6g）逐渐加入上清液内，边加边搅拌（冰浴下）。⑺以刚果红试纸测中和点，待试纸不变蓝即达到中和。收集于标本瓶（或广口瓶）内，置冰箱备用。此液不稳定，置冰箱内可保存两周，若变为橘红色则失效。2．偶氮反

8、应—Carnoy固定的大鼠肝、肠等石蜡切片。⑴切片脱蜡至水。⑵将切片放入下列溶液中（在冰浴中至2～3℃），浸染10分钟。用前配制：四氮化联邻茴香胺溶液4ml0.1巴比妥缓冲液（pH9.2）20