海地瓜蛋白水解物中ace抑制肽的分离纯化及合成

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1、万方数据V01．332012年2月高等学校化学学报CHEMICALJOURNAL0FCHINESEUNIVERSnlESNo．2308_312海地瓜蛋白水解物中ACE抑制肽的分离纯化及合成赵元晖1，李八方1，马敬军2，董士远1，刘尊英1，曾名滂1(1．中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛266003；2．中国检验认证集团山东有限公司，青岛266071)摘要采用sephadexG-25凝胶柱层析、sPsephadexc-25阳离子交换层析和反相高效液相色谱等方法对海地瓜水解产物进行分离纯化，得到了一种新的强活性AcE抑制肽，其氨基酸序

2、列为MEGAQEAQGD，lC∞值为15．9斗moL／L．采用逐步缩合和片段缩合的方法对该抑制肽进行了设计合成．合成肽的纯度为99．72％，分子量与序列结构均与理论值相符．研究发现，抑制肽与胃蛋白酶和糜蛋白酶水解反应后，活性增强了3．5倍．动物实验结果表明，剂量为3斗moL／kg的抑制肽对大鼠自发性高血压具有明显的降压效果．关键词海地瓜；ACE抑制肽；分离纯化中图分类号0629．72文献标识码AD0l：10．3969／j．issn．0251聊90．2012．02．017海地瓜(Aco以iM啪咖口砒矗勉Semper)俗称香参，也称为海

3、茄子，盛产于亚热带沙质海区，在日本、菲律宾、印度尼西亚及我国山东到海南岛的海域均有分布，资源丰富．海地瓜含有丰富的氨基酸和有益于人体的多种微量元素及维生素，这为进一步开发利用海地瓜资源提供了一定的科学依据．目前，我国的高血压病发病率呈逐年上升趋势，已成为仅次于肿瘤的第二大疾病，不仅严重威胁人们的生命安全，而且严重影响我国社会经济的发展．这就要求人们不仅要有高效的治疗药物，还要从预防高血压做起¨’2J．目前已有不少有关酶解食物蛋白制备具有AcE抑制活性肽的研究报道【3。J．来自于纯天然食物蛋白质的ACE抑制肽对正常血压无影响并且安全可

4、靠∞娟J．本文利用凝胶柱层析、阳离子交换层析、反相高效液相色谱等纯化技术从海地瓜蛋白酶解物中分离出具有高活性的ACE抑制肽，应用纳升电喷雾．四极杆-飞行时间串联质谱(Nano-ESI—Ms／Ms)技术，对活性肽进行结构鉴定，并采用逐步缩合和片段缩合相结合的方法对该肽进行了设计合成．这不仅可以提高海地瓜的综合利用价值，还可以通过对降压机理及肽结构的深入研究为提取或合成高血压治疗药物提供实验基础．1实验部分1．1试剂与仪器海地瓜购于青岛市天桥综合超市，冷冻制品，湿重平均每只25g，去除内脏洗净备用；雄性自发性高血压大鼠(SHR，SPF)

5、，每只280一300g，购于上海斯莱克斯实验动物有限公司；马尿酰．组氨酰．亮氨酸、菠萝蛋白酶、ACE酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶为sigrna公司产品；Alcalase2．4L酶(丹麦诺维信公司)；SPsephadexc-25和sephadexG-25(Ph锄acia公司)；氨基酸Boc．Met．OH，Fmoc—Glu(OtBu)一OH，Boc—Gly—OH，H—Ala-OBzl．ToSH，Fmoc-Gln(Tn)一OH和H—Asp(OBzl)2·ToSH，缩合剂DCC，EDC，HOAt和HOBt以及缚酸剂NMM均购自上海吉尔生

6、化公司．高效液相色谱仪(美国A舀lent公司)；JNM·ECP600核磁共振谱仪(日本JEOL公司)；Nexus670型傅里叶变换红外／拉曼光谱仪(美国Nicolet公司)；HP：5890-HP：597lA色谱质谱联用仪(美国惠普公司)．收稿日期：2011抛．23．基金项目：国家自然科学基金(批准号：31000830)和山东省自然科学基金(批准号：zR20locQ001)资助．联系人简介：曾名滂，男，博士，教授，主要从事水产品高值化利用研究．E·mail：lIIingyz@mail．ouc．edu．cn赵元晖，男，博士，讲师，主要从

7、事海洋生物活性物质研究．E一删lil：zIl∞yllmhui@o∽．edu．cn万方数据No．2赵元晖等：海地瓜蛋白水解物中AcE抑制肽的分离纯化及合成3091．2实验过程1．2．1体壁蛋白的提取参照文献[9，10]方法并进行了改进．将海地瓜体壁加入蒸馏水打成碎块，用8倍体积O．05moL／L的NaOH溶液搅拌过夜，去除NaoH溶液，残渣用蒸馏水冲洗至中性，加入蒸馏水打浆，于45℃恒温搅拌抽提8h，离心(10000r／min，20min)分离得热水溶性蛋白溶液．1．2．2酶解液的制备以海地瓜蛋白(配制成浓度为O．Olg／mL的溶液)

8、为原料，先采用菠萝蛋白酶(45℃，pH=7．0，加酶量为海地瓜蛋白质量的1．0％)对其进行水解4h，再用AlcaJase蛋白酶(55℃，pH=7．4，加酶量为海地瓜蛋白质量的2．0％)水解2h．所得复合酶水解液经过2000分子量的膜超