《疫化学技术》PPT课件

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1、酶联免疫吸附反应(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)什么是酶联免疫分析技术ELISA的基本原理和方法ELISA的种类和变化ELISA的特点ELISA的应用实例一、基本原理是利用抗原抗体进行的检测技术。即利用制备好的特异抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）ELISA原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标

2、抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便讯速，特异性强。二、酶及其底物酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，

3、将得到不同的颜色反应.酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,450420ELISA的种类和变化（一）双抗体夹心

4、法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原双抗体夹心法（HBsAg、HBeAg等）示意图固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的

5、封闭蛋白加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。（1）双抗体夹心法测定抗原A.将抗体吸附于固相表面;B.加抗原，形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。双抗原夹心法（抗-HBs等）

6、示意图1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗原，则结合为抗原-抗体-酶标记抗原复合物。4.酶催化底物并显色。酶抗原酶标记抗原抗体抗原固相载体双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。（二）间接法酶抗抗

7、体酶标记抗抗体抗体抗原固相载体1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。4.酶催化底物并显色。间接法（抗-HCV等）示意图间接法测抗体传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。包被固相载体:用已知抗原包被固相载体加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体加底物显色根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定（三）

8、竞争法此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。用已知特异性抗体包被固相载体测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体