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1、三代遗传标记分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点:①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻
2、译),而不改变基因结构即DNA的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型,提供完整的遗传信息。⑥DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1.1 第1代分子标记 1.1.1 RFLP标记技术。
3、 1980年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP)可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。RFLP是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小,反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA序列上的微小变化,甚至1个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生,导致酶切片段长度的变化。 优点：RFLP标记的等位基因具有共显性的特点,结
4、果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。 缺点：在进行RFLP分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高,RFLP连锁图上还有很多大的空间区。 1.1.2 RAPD标记技术。 为了克服RFLP技术上的缺点,Williams等于1990年建立了随机扩增多态DNARandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术,由于其独特的检测DNA多态性的方式使得RAPD技术很快
5、渗透于基因研究的各个领域。RAPD是建立于PCR基础之上的分子标记技术,基本原理是利用一个随机引物(8～10个碱基)通过PCR反应非定点地扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究。对任一特定引物而言,它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性。 优点：与RFLP相比,RAPD技术简单,检测速度快,DNA用量少,实验设备简单,
6、不需DNA探针,设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好。 缺点：当然,RAPD技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同
7、位素,安全性好。当然,RAPD技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降;其次,RAPD对反应条件相当敏感,包括模板浓度、Mg2+浓度,所以实验的重复性差。1.1.3 AFLP标记技术 扩增片段长度多态技术(AFLP),又名限制片段选择扩增技术(Selectiverestrictionfragmentamplifi2cation,SRFA),于1993年
8、由荷兰KEYGENE公司的Zabean和Vos等发明,并已申请专利。AFLP是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术,它将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补)连接起来,并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段,从而形成指纹图谱的分子标记技术。AFLP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。 优点：它兼具RAPD与RFLP的优点,有较高的稳定性,用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点,并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条
