PCR及分子遗传标记

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1、PCR技术及常用DNA分子标记授课教师：吴海龙研究方向：分子生态学及保护遗传学Email:whlong@mail.ahnu.edu.cn一、PCR技术及其应用PCR产生的历史PCR，PolymeraseChainReaction。Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA的设想。1983年，Mullis发明了PCR技术，使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热TaqDNA聚合酶引入了PCR技术1989年美国《Scienc

2、e》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR原理：类似于DNA的体内复制。变性：首先待扩增DNA模板加热变性解链；引物退火：反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火延伸：再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR技术的特点高度的灵敏性：PCR产物每轮循环增加一倍，30个循环后，可达109个拷贝特

3、异性：引物序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增操作简便易行：PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列，而利用经典的分子克隆法获得目的DNA片段则需要数周的时间。引物设计：序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。引物长度以15-40bp为宜。碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。引物内部避免形成二级结构。两引物间避免有互补序列。引物3’端为关键碱基；

4、5’端无严格限制。3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列、启动子序列、定点突变、探针标记PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补，延伸需将反应温度升至中温(72℃)，在Tap多聚酶的作用下，以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品是经过30次循环，最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特

5、异区段的DNA带。PCR技术的基本过程（1）模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物Buffer94oC5’TaqDNA聚合酶反应体系PCR技术的基本过程（2）Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min25-35个循环琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程（3）PCRoptimizationDNA模板：单、双链DNA均可；不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类；一般100微升

6、体系中DNA模板100ng。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。引物浓度：0.1-0.5umol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。TaqDNA聚合酶：0.5-2.5U/50ul；酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。dNTP：四种dNTP浓度应相等，dNTP浓度取决于扩增片段的长度，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，工作浓度：0.5mmol/L-2.5mmol。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；过高

7、影响反应特异性。变性温度和时间：92-95℃，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。退火温度与时间：引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55℃、1-2分钟。延伸温度和时间：温度：72℃，接近Taq酶的最适75℃；时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。循环次数：循环过多，非特异性产物大量增加生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学PCR技术的用途PCR类型8.1不对称PCR目的：扩

8、增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是0.01:0.5μM，关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组DNA结构功能的研究高浓度引物低浓度引物8.2反向PCR(reversePCR)原理：是用反向互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。用途：可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩