5 凯氏定氮法

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1、五&六、总氮量的测定--凯氏定氮法一、目的学习凯氏定氮法的原理和操作技术。二、实验原理蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以6.25，就可以计算出样品中的

2、蛋白质含量。蛋白质总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：CH2NH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH32NH3+H2SO4→（NH4）2SO4有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h或更长时间，视样品的性质而定。消化反应方程式：消化完毕后，加入过量浓碱（（如NaOH），

3、硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H+浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H+浓度为止。（NH4）2SO4+NaOH→Na2SO4+2NH4OHNH4OH→NH3+H2O+3NH3+H3BO3→3NH4++BO33-BO33-+3H+→H3BO33最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中总氮量。三、试剂1.面粉0.1g（对照3、4滴蒸馏水)2.消化液：过氧化氢：浓硫酸：水的比例为3∶2∶1，临用时配制（防止腐蚀，小心）。3.催化剂：硫酸铜(CuSO4•

4、5H2O)与硫酸钾(K2SO4)以1：3配比研磨混合。4.30%氢氧化钠溶液5.2%硼酸溶液6.标准盐酸溶液(约0.01mol/L)7.混合指示剂(田氏指示剂)混合指示剂由50mL0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1%甲基红乙醇溶液混合配成贮于棕色瓶中配用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄且很灵敏。四、操作方法（一）消化1、编号：取1支清洁干燥的消化管编号，编号后在每瓶内各加1粒玻璃珠。2、加样：在1号管中各加样品0.1g（面粉），加催化剂0.2g，混和消化液5mL。注意加样品时应直接送入瓶底，而不要黏在瓶口和瓶颈上。在2号瓶中加蒸馏水3

5、-4滴代替样品，其他试剂同样品瓶，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。3、加热消化：摇匀后，每个瓶口放一漏斗（防止气体冲出），在通风厨内于远红外消煮炉上消化。开始消化时应以微火加热，不能让液体冲到瓶颈或冲出瓶外，否则将严重地影响样品测定结果。待瓶内水汽蒸完，H2SO4开始分解放出SO2白烟后，适当加强火力，使瓶内液体微微沸腾而不致跳荡。继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止（消化颜色变化：碳化黑色→红色（Cu2SO4，亚铜呈现褐色）→白色烟雾→透明淡绿色）。3实验六凯氏定氮--测定一、原理：（NH4）2SO4+NaOH→Na2SO4+2NH4OHNH4

6、OH→NH3+H2O+NH3+H3BO3→（NH4）H2BO32、蒸馏：3、滴定：NH4H2BO3+HCl→NH4Cl+H3BO3二、操作：2）定容：消化完毕，待烧瓶中液体完全冷却后，缓慢沿瓶壁加蒸馏水10mL，随加随摇，分批加入蒸馏水至消化管上刻度（50mL），混匀备用；3）蒸馏：干净的锥形瓶+1、2滴田氏指示剂，取10ml消化液→蒸馏瓶田氏指示剂的变色范围窄：pH5.25.45.6紫红暗蓝绿色凯氏定氮仪的设定：a)将NaOH、硼酸、蒸馏水塑料桶拧紧（不漏气）；b)打开冷凝循环水；c)开机，显示“P”，按“转换”钮，设定加酸（1S），加碱（1S）（12ml/S

7、）；d)放好大试管（含10ml消化液），上端密闭；将加入指示剂的三角瓶放在托盘上；e)按启动，仪器开始工作，等三角瓶颜色变绿时，计时1~2min后，按下托盘，6S后听到“滴滴”声，机器停止工作；f)先取出大试管（湿毛巾取，烫），待收集管无残留液时取出锥形瓶，贴壁，用蒸馏水冲洗排出口→滴定。4）滴定全部蒸馏完毕后，用0.01mol/L标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸—指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点，记录所耗HCl溶液量。五、计算C（V1－V2）×14×%×测定时消化液用量（mL）样品中的总氮量（%）=消化液总量（mL）W×10003C为标

8、准盐酸溶液摩尔浓度V1为