《氨基酸分析》PPT课件

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1、1第二章氨基酸分析2氨基酸分析在蛋白质化学和生物技术研究、临床诊断和细胞生理学研究、营养学与卫生保健、培育农作物优良品种、食品、制药等领域具有非常重要的意义。氨基酸分析3氨基酸的基本结构及性质氨基酸是分子中含有氨基和羧基的一类化合物。组成蛋白质的氨基酸只有二十种。其中有八种为人体必需氨基酸。人体必需的氨基酸：人体内不能合成，只有靠食物供给的氨基酸。各种蛋白质含氨基酸的种类和数量都各不相同。4氨基酸的分类1、根据氨基酸的酸碱性酸性氨基酸碱性氨基酸中性氨基酸氨基酸5酸性氨基酸二个羧基一个氨基天冬氨酸谷氨酸碱性氨基酸一个羧基二个或二个以上氨基赖氨酸精氨酸组氨酸中性氨基酸一个

2、羧基一个氨基实际水溶液呈弱酸性：电离能力COOH>NH262、根据氨基酸的化学特性疏水性：Ala（丙氨酸）Val（缬氨酸）Leu（亮氨酸）Ile（异亮氨酸）Phe（苯丙氨酸）Pro（脯氨酸）Met（蛋氨酸）带电：Arg（精氨酸）Lys（赖氨酸）Asp（天冬氨酸）Glu（谷氨酸）(His)组氨酸极性：Tyr（酪氨酸）Trp（色氨酸）Ser（丝氨酸）Cys（半胱氨酸）Thr（苏氨酸）Asn（天冬酰胺）Gln（谷氨酰胺）His（组氨酸）特殊：Gly(Pro)甘氨酸脯氨酸氨基酸的分类7带电氨基酸8极性氨基酸9氨基酸的立体化学由蛋白质水解的氨基酸都为α-氨基酸，除甘氨酸外，所有

3、α-C都为手性碳原子。天然的氨基酸均为L-氨基酸10氨基酸的理化性质1.溶解度2.熔点:高3.旋光性有旋光性4.味感：D-氨基酸大多带甜味，L-氨基酸有苦、甜、鲜、酸等四种不同味感。1.两性性质：氨基酸分子中含有氨基及羧基，使其既能象酸又能象碱一样解离；2.与甲醛作用：3.与2,4-二硝基氟苯作用：4.与茚三酮的作用：5.与异硫酸苯酯的作用：6.与荧光胺的作用：7.与5,5‘-双硫基-双(硝基苯甲酸)反应11等电点概念：将氨基酸水溶液的酸碱度加以适当地调节，使氨基酸的酸性电离程度与碱性电离程度相等。此时，氨基酸带有的正电荷数目和负电荷数目相等，此溶液的pH值称为氨基酸

4、的等电点，用pI表示。在等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀等电点可用酸碱滴定方法测定，也可通过pK值计算侧链无解离基团时：pI=(pK1+pK2)/2侧链有解离基团时,pI相当于氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK值和的一半12pH=pI净电荷为零在电场中不移动pHpI带负电荷等电点要使氨基酸达到等电状态：中性氨基酸：pIpH7加碱13与茚三酮的显色反应水合茚三酮CO214蓝紫色化合物根据CO2的量或蓝紫色的深浅程度作为α-氨基酸定量分析的依据。与茚三酮的

5、显色反应15氨基酸的定量斑点分析大多数氨基酸不含有特征发色基团。因此，氨基酸的分析依赖于衍生化反应。对衍生化试剂的要求是反应快，并且产物与试剂本身的光谱性质有明显的差异。常用的衍生化试剂有2，4-二硝基氟苯、荧光胺及邻苯二甲醛等。根据产物性质的不同，衍生化试剂可分为显色剂及荧光衍生化试剂两大类。16斑点显色分析法茚三酮是氨基酸的斑点显色分析中非常简单的衍生化试剂。它可以与一级和二级胺在酸性介质中pH（3～4）加热反应，反应产生氨、二氧化碳和蓝-紫色的络合物。一级和二级胺的检测波长分别为570和440nm。若二者同时存在，一般在500nm处测定，灵敏度有所降低。1

6、7另一种常用的显色反应试剂是2，4-二硝基氟苯，它可以与样品中氨基酸及一级和二级胺反应，生成黄色络合物，检测波长在420nm。该法测定的是氨基酸的总量。斑点显色分析法18斑点荧光分析法荧光胺是用于氨基酸分析的高灵敏荧光衍生化试剂，可用于氨基酸的表面分析，如薄层色谱。邻苯二甲醛（OPA）是用于氨基酸荧光分析的另一种常见的衍生化试剂。19色谱方法离子交换色谱法反相色谱分析法柱前衍生气相色谱法衍生化毛细管电泳法20离子交换色谱法离子交换色谱的基本原理是基于带电荷的阴阳离子与带相反电荷的离子交换基团的相互作用。氨基酸、肽和蛋白质在溶液中带电荷，可与离子交换基团产生静

7、电作用而保留。其固定相应具有分离效能高、物化性质稳定、柱容量大、分辨率高、能快速保持生物分子活性和构象完好。21阳离子交换树脂：强酸型磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。阴离子交换树脂：只有在特殊情况下用于强酸性氨基酸的分析。离子交换色谱法221、直接检测法离子交换色谱法用于氨基酸分析时，可在200nm处对各种氨基酸进行直接检测，检出限在1～10pmol之间。23（1）选择性差：生物样品中多种内源性成分在200nm处均有吸收；（2）背景高：HPIC常用的各种溶剂在200nm处也有吸收。直接检测的缺点242、柱后衍生化法衍生化是将氨基酸衍生为有