《核酸分离检测》PPT课件

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1、第五章核酸的分离与检测一、核酸的分离、提取通则核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。1.细胞裂解机械作用：低渗、超声、微波、冻融裂解和颗粒破碎等。不适于高分子量长链核酸的分离。化学作用：一定pH和变性条件下，细胞破裂，蛋白变性沉淀，核酸→水相。变性条件：加热、表面活性剂(SDS、TritonX-100、Tween20、NP-40等)、强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍等)。pH环境：强碱(NaOH)或

2、缓冲液(TE、STE等)。金属离子螯合剂(EDTA等)螯合Mg2+、Ca2+，抑制核酸酶活性。酶作用：溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)破裂细胞。降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。联合使用：细胞、待分离核酸类型及后续实验目。2.酶处理裂解液中加入蛋白酶（蛋白酶K或链酶蛋白酶），降解蛋白质；灭活核酸酶（DNase和RNase）加入DNase和RNase去除不需要的核酸。防止核酸的降解和变性防止过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏（一般在pH4-10下进行）;避免剧烈搅拌；防止核酸酶（DNase,RNase）的作用。抑制DNase：可加柠檬

3、酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。抑制RNase：实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethylpyrocarbonate,DEPC）处理。加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。质粒DNA的提取——碱裂解法溶液I：50mM葡萄糖，25，10mMEDTA，pH8.0——Tris-Cl→pH；葡萄糖→大肠杆菌悬浮；EDTA→金属离子螯合剂。溶液II：0.2NNaOH，1%SDS——NaOH→碱裂解细胞，控制时间

4、，温柔混合；SDS→结合蛋白。溶液III：3M醋酸钾，2M醋酸——醋酸钾→PDS沉淀；醋酸→中和碱。3.核酸的分离与纯化高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性。根据理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法。①酚提取/沉淀法经典方法是酚:氯仿抽提法。裂解细胞；离心分离含核酸水相；等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1体积)混合液抽提，漩涡振荡混匀(小分子量核酸)/颠倒混匀(高分子量核酸)，离心分离；疏水性的蛋白质→有机相，核酸→上层水相。缓冲液饱和酚——蛋白变性；氯仿增加有机相比重，防止酚流入水相；异戊醇可减少操作过

5、程中产生的气泡，下层的界面更清晰。核酸盐经有机溶剂沉淀浓缩酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀水相加pH5.0～5.5，终浓度0.3MNaAc或KAc（钠离子中和核酸磷酸骨架负电荷，在酸性环境中促进核酸疏水复性），加2～2.5倍体积乙醇，沉淀核酸。离心收集，70%乙醇漂洗核酸沉淀除盐分。其他可用于沉淀核酸的有机溶剂：异丙醇、聚乙二醇(PEG)等；盐类：10.0mol/L醋酸铵、8.0mol/L的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等。分离沉淀DNA②层析法利用物质些理化性质差异建立的分离分析方法。包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等。商品试剂盒，分离和纯化同步进行。

6、一定离子环境下，核酸被选择性地吸附到硅土、硅胶或磁珠等表面与其他生物分子分离。结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。核酸质量好、产量高、成本低、快速、简便、节省人力以及易于实现自动化。Promega质粒纯化系统以磁性颗粒为基础：采用磁性技术高通量纯化直接用于转染及其它生物学实验的质粒。以膜为基础：采用硅化膜纯化柱，可用离心法进行纯化。以树脂为基础：利用树脂，真空法。DNA在高盐条件下对硅树脂、膜的高亲和力。全自动核酸分离纯化系统RocheMagNAPure96MagNAPureLC2.0二、核酸含量的测定核酸是由磷酸、戊糖、碱基所组成的核苷酸的

7、多聚高分子。三者以等分子数而存在，所以只要测定三者中任何一处成分的含量，就可推算出核酸的含量。常用的核酸测定方法有：紫外吸收法、定磷法、定糖法RNA的定量测定：地衣酚法DNA的定量测定：二苯胺法紫外吸收法中DNA或RNA的定量A260=1.0相当于:50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸分光光度计BiophotometerNanophotometerSingleandmultiwavelengthmeasurementcombinedwithkineticmethods.Thefullwavelengths

8、can(190nm-1100nm)allowscurveinterpretationforattainmen