病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)

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1、实践三病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）实践目的：1．掌握血凝（HA）和血凝抑制(HI)试验的原理2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法实践原理：某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。实践内容：1．红细胞凝集试验(HA试验)主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。鸡新城疫病毒的HA试验现采用微量法，在V形微量反应板上进行。(1

2、)首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25µl)。(2)用微量移液器取病毒抗原液25µl加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25µl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25µl液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2～1:2048，第12孔为红细胞对照。(3)再以微量移液器每孔加1.0％红细胞悬浮液1滴(25µl)。(4)在振荡器上振荡混匀约l～2分钟，再置37℃作用15分钟后观察结果。(5)每次测定样品都应同时做红细胞对照。表1鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式(微量法)孔号123456789101112病毒稀

3、释倍数1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl病毒液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl弃去1％红细胞悬液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl感作置振荡器上混匀1～2分钟，放37℃静置15分钟结果例示#######++----#表示100％完全凝集++表示50％凝集-表示不凝集结果判定：将反应板倾斜

4、成45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例：病毒液的HA效价为1:128，HI试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4＝32倍的稀释液。2.红细胞凝集抑制试验(HI试验)有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。(1)用微量移液器每孔各加入1滴稀释液(即25µl)，从第1孔到第10孔。第1l孔加稀释液2滴(50µl)。(2)

5、以微量移液器取被检血清25µl，放入第1孔，，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀，再吸取25µl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第10孔，最后第十孔吸取25µl液体弃掉；被检血清稀释倍数依为1:2～1:1024，第11孔为红细胞对照，第十二孔为抗原对照。(3)每孔再加入含有四个单位的病毒液1滴(25µl)至第10孔，第1l孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液。(4)置振荡器上振荡l～2分钟后，放37℃静置20分钟。(5)每孔再加入1.0％红细胞悬浮液1滴(25µl)放振荡器上振荡l～2分钟混匀，置37℃，15分钟后判定结果。表2鸡新城

6、疫红细胞凝集抑制(H1)试验(微量法)孔号123456789101112被检血清稀释倍数1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024红细胞对照抗原对照生理盐水25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl50µl25µl被检血清25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl弃掉4单位病毒液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl振荡器上振荡1～2分钟，放37℃作用20分钟1%红细胞悬液25µl25µl25µl25µl

7、25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl振荡器上振荡1～2分钟，放137℃作用15分钟结果例示-------++##-#注：-表示不凝集、++表示部分凝集、#表示完全凝集。结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被