各种酶切位点的保护碱基(引物设计必看)

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1、各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。寡核苷酸近末端位点的酶切(CleavageClosetotheEndofDNAFragments(oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶

2、，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mMTris-HCl(pH7.6),10mMMgCl2,5mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。酶寡核苷酸序列链长切割率%

3、2hr20hrAccIGGTCGACCCGGTCGACCGCCGGTCGACCGG81012000000AflIIICACATGTGCCACATGTGGCCCACATGTGGG810120>90>900>90>90AscIGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA81012>90>90>90>90>90>90AvaICCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGA8101250>90>90>90>90>90BamHICGGATCCGCGGGATCCCGCGCGGATCCGCG8101210>90>9025>90>90BglIICAGATCT

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