GB 15193.4-1994 鼠伤寒沙门氏菌 哺乳动物微粒体酶试验

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1、中华人民共和国国家标准鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物GB15193.4一94微粒体酶试验Salmonellatyphimurium/mammalsmicrosomalenzymetest(Amestest)主题内容与适用范围本标准规定了Ames试验的基本技术要求。本标准适用于检测环境有害物质的致突变作用。2原理鼠伤寒沙门氏菌的突变型(即组氨酸缺陷型)菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型(表现型)，因而在无组氨酸培养基上也能生长，故可根据菌落

2、形成数量，检查受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统可以用多氯联笨(PCB)诱导的大鼠肝匀浆(S-9)制备的S-9混合液。3仪器3.1实验室常用设备。3.2低温高速离心机，低温冰箱(-80`C)或液氮罐，洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，蒸气压力锅，匀浆器等。4培养墓制备及试剂的配制培养基成分或试剂除说明外至少应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4℃不超过六个月，其他详见下述各培养基及溶液说明。4.1营养肉汤培养基牛肉膏2.5g胰陈(或混合蛋白陈

3、)5.0g氯化钠2.5g磷酸氢二钾(K2HP0,·3H20)1.3g蒸馏水500mL加热溶解，调pH至7.4，分装后。.103MPa20min灭菌，普通冰箱保存备用，保存期不超过半年。4.2营养肉汤琼脂培养基:用作a基因型鉴定的结晶紫敏感试验，抗氨节青霉素和四环素试验，紫外线敏感性试验。b.细菌活力鉴定。琼脂粉1.5g营养肉汤培养基100mL一一，一.-.一一一-一.，一~一目.一，一.-一.--~-一~叫一一一.~一一一~，-中华人民共和国卫生部1994一08一10批准1994一08门0实施Gs15193.4一94加热融化后调pH为7.4

4、,0.103MPa20min灭菌。4.3底层培养基所需试剂及配制方法如下:4.3.1磷酸盐贮备液磷酸氢钠钱(NaNH4HP04·4H20)17.5g柠檬酸(C6Ha07·H20)10.0g磷酸氢二钾(K}HPOO50.0g硫酸镁o(MgS04·7H}O)1.0g加蒸馏水至100mL,O.103MPa20min灭菌。注:1)待其他试剂完全溶解后再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解，否则易析出沉淀。4.3.240%葡萄糖溶液葡萄糖40.0g加蒸馏水至100mL,0.055MPa20min灭菌。4.3.31.5%琼脂培养基琼脂粉6.09蒸馏水400mL

5、融化后0.103MPa20min灭菌。4.3.4底层培养基(无菌操作)趁热(80'C)，在灭菌琼脂培养基中(400mL)依次加人:磷酸盐贮备液8mL40%葡萄糖溶液20mL充分混匀，待凉至80℃左右时倒平皿，每皿.90mm)25mL,37℃培养过夜以除去水分及检查有无污染.4.4顶层培养基的成分及制备4.4.1顶层琼脂琼脂粉3.0g氯化钠2.59加蒸馏水至500mL4.4.20.5mmol/L组氨酸一生物素溶液(诱变试验用)D一生物素(分子量244)30.5mgL一组氨酸(分子量155)17.4mg加蒸馏水至250mL,4.4.3顶层培养基

6、制备:加热融化顶层琼脂，每100mL顶层琼脂中加10mL10.5mol/L组氨酸一生物素溶液。混匀，分装在100mL三角瓶中，0.103MPa20min灭菌。用时融化分装小试管，每管2mL,在45℃水浴中保温。4.5特殊试剂和培养基的配制4.5.10.8%氨节青霉素溶液(鉴定菌株用，无菌配制)称取氨苇青霉素40mg，用。02mol/L氢氧化钠溶液稀释至5mL，保存于冰箱。4.5.20.1%结晶紫溶液(鉴定菌株用)称取100mg结晶紫，溶于100mL无菌水。4.5.3L一组氨酸溶液和。.5mol/LD一生物素溶液(鉴定菌株用)称取L一组氨酸0

7、.4043g和D一生物素12.2mg，分别溶于100mL蒸馏水，0.103MPa20min灭菌，保存于4℃冰箱。4.5.40.8%四环素溶液(用于四环素抗性试验和氨节青霉素一四环素平板)Gs15193.4一94称取40mg四环素，用。.02mol/L盐酸稀释至5mL，保存于4℃冰箱。4.5.5氨节青霉素平板(用作TA97,TA98,TA10。菌株的主平板)和氨节青霉素一四环素平板(用作TA102菌株的主平板)每1000mL中由以下成分组成:底层培养基910mL磷酸盐贮备液20mL40%葡萄糖溶液50mL组氨酸水溶液(0.4043g/100m

8、L)10mL。.5mol/L生物素6mL。.8%氨节青霉素溶液3.15mL0.8%四环素溶液0.25mL四环素仅在使用对四环素有抗性的TA102时加入。以上成分均已分别灭菌或无菌