DBS32 014-2017 食品安全地方标准 食源性致病微生物快速检测

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1、DBS江苏省地方标准DBS32/014—2017食品安全地方标准食源性致病微生物快速检测2017-11-27发布2017-11-27实施江苏省卫生和计划生育委员会发布DBS32/014—2017前言本标准系首次发布。IDBS32/014—2017食品安全地方标准食源性致病微生物快速检测1范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血性弧菌和志贺氏菌的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于肉制品、水产制品、即食蛋制品、粮食制品、即食豆类制品、巧克力类及可可制品、即食果蔬制品、饮料

2、、冷冻饮品、即食调味品、坚果籽实制品等食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血性弧菌和志贺氏菌的快速检测。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1实时荧光PCR仪。2.2冷冻离心机：12000r/min，4ºC。2.3均质器。2.4恒温空气振荡摇床：36ºC±1ºC、30ºC±1ºC、42ºC±1ºC。2.5恒温水浴锅：95ºC±1ºC。2.6天平：感量0.01g。2.7冰箱：2ºC~5ºC、-20ºC。2.8微量移液器：0.1μL-2.5μL、1μL

3、-10μL、10μL-100μL、100μL-1000μL。2.9灭菌吸头：10μL、200μL、1000μL。2.10厌氧培养装置。2.11灭菌1.5mL离心管。3试剂与培养基3.1PCR实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格，121ºC高压灭菌30min。3.2TaqDNA聚合酶：5U/μL。3.3脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）：10mmol/L。3.4DNA提取试剂：称取0.1gchelex100粉末，加入灭菌蒸馏水定容至100mL，保存于-20ºC备用；或使用商品化的DNA提取试剂盒。3.510×PCR缓冲液：200mmo

4、l/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。3.6引物和探针：引物和探针序列见附录A，加水稀释至10μmol/L，其中探针的5’端标记FAM，3’端标记TAMRA。3.7培养基3.7.17.5%氯化钠肉汤：见GB4789.10。1DBS32/014—20173.7.2缓冲蛋白胨水（BPW）：见GB4789.4。3.7.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见GB4789.4。3.7.4四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见GB4789.4。3.7.5李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见GB4789.

5、30。3.7.6改良EC肉汤（mEC+n）：见GB4789.36。3.7.73%氯化钠碱性蛋白胨水：见GB4789.7。3.7.8志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见GB4789.5。4操作步骤4.1样品制备和增菌培养4.1.1金黄色葡萄球菌样品处理步骤按照GB4789.10进行，将处理后的7.5%氯化钠肉汤样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，36ºC±1ºC，200r/min振摇8h。4.1.2沙门氏菌样品处理步骤按照GB4789.4进行，将处理后的BPW样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，36ºC±1ºC、200r/min振摇4h。从培养后

6、的样品匀液中移取1mL，转接种于10mLSC增菌液，置于36ºC±1ºC恒温空气振荡摇床，200r/min振摇4h。另取1mL，转接种于10mLTTB增菌液，置于42ºC±1ºC恒温空气振荡摇床，200r/min振摇4h。4.1.3单核细胞增生李斯特氏菌样品处理步骤按照GB4789.30进行，将处理后的LB1样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，30ºC±1ºC、200r/min振摇4h；移取0.1mL，转种于10mLLB2增菌液内，30ºC±1ºC，200r/min振摇4h。4.1.4大肠埃希氏菌O157：H7样品处理步骤按照GB478

7、9.36进行，将处理后的改良EC肉汤样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，36ºC±1ºC，200r/min振摇8h。4.1.5副溶血性弧菌样品处理步骤按照GB4789.7进行，将处理后的3%氯化钠碱性蛋白胨水样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，36ºC±1ºC，200r/min振摇8h。4.1.6志贺氏菌样品处理步骤按照GB4789.5进行，将处理后的志贺氏菌增菌肉汤样品匀液放置于厌氧培养装置中，41.5ºC±1ºC厌氧培养8h。4.2致病菌DNA提取分别取4.1培养后的增菌液1mL，加入1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5m

8、in，吸弃上清；加入50μLDNA提取试剂（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后置于95ºC±1ºC水浴5min，12000r/min，4ºC离心5min，取上清，-20ºC保存，作为模板DNA备用。注：也可使用