《提取和分离》PPT课件

《《提取和分离》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第三章DNA的提取与纯化基因工程需要三种不同的DNA:总DNA质粒DNA噬菌体DNA学习内容：制备细胞总DNA培养、搜集细菌细胞制备细胞提取物DNA纯化、浓缩从其他生物中提取总DNA质粒DNA提取根据分子大小分离根据结构分离质粒扩增提取噬菌体DNA噬菌体的培养制备非溶源性噬菌体收集噬菌体从λ噬菌体中纯化DNA纯化M13DNAFigure3.1ThebasicstepsinpreparationoftotalcellDNAfromacultureofbacteriaBasicSteps1.制备总DNA基本步骤：1)收集细菌细胞2)打

2、碎细胞，释放内容物3)去掉DNA以外的成分4)DNA溶液的浓缩1.1培养、搜集细菌细胞两种类型的细菌培养基的成分：M9培养基：Na2HPO4(6.0)KH2PO4(3.0)NaCl(0.5)NH4Cl(1.0)MgSO4(0.5)Glucose(2.0)CaCl2(0.015)LB培养基：Yeastextract(5)NaCl(10)1.1培养、收集细菌细胞37°C，150-250rpm达到最大浓度2-3×109cell/ml,600nm下的OD值，1OD相当于0.8×109cell/mlFigure3.2Estimationof

3、bacterialcellnumberbymeasurementofopticaldensityFigure3.3Harvestingbacteriabycentrifugation1.2制备细胞提取物利用溶菌酶、EDTA或两者结合。溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，消化多聚物。EDTA络合保持细胞结构完整的镁离子，也可以抑制细胞中降解DNA酶的活性。一般溶菌酶或EDTA足以破坏细菌细胞，在提取液中同时还加入SDS。Figure3.4Preparationofacellextract.Preparationofacelle

4、xtractFigure3.5Removalofproteincontaminantsbyphenolextraction.◆PurificationofDNAfromacellextract1.制备细胞总DNA1.4DNA的浓缩与浓度测定最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀。260nm下测定吸光度，1OD相当于50μg双链DNA/ml。A260/A280=1.8，<1.8表示含有酚或蛋白质,>2说明有RNAFigure3.6CollectingDNAbyethanolprecipit

5、ation.◆ConcentrationofDNAsamplesFigure3.7TheCTABmethodforpurificationofplantDNA◆PlantDNA(CTAB法)十六烷基三甲基溴化铵Figure3.8Theuseofananion-exchangechromatographyresininDNApurification.阴离子交换层析法2质粒DNA提取质粒DNA的大小（8%）。DNA的构造◇Alkalinedenaturation◇Ethidiumbromide（溴化二氨乙苯啡啶）-caesiumchl

6、oride（氯化铯）densitygradientcentrifugation2质粒DNA提取2.1根据分子大小提取质粒DNAsphaeroplasts裂解细胞可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整。问题：裂解液中不可避免的包含一些染色体DNA质粒分子非常大时，将与染色体DNA共沉淀Figure3.9Preparationofaclearedlysate.Sphaeroplast残壁细胞2质粒DNA提取2.2根据分子构造提取碱裂解法基本原理：在非常窄的pH范围内，非螺旋化的DNA会变性，而螺旋化的质粒不变性。在裂解液中加入氢氧化钠

7、，调pH值至12.0~12.5,破坏氢键，使DNA变性。加入酸，变性的细菌DNA进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。另外一个优点，利用SDS（十二烷基磺酸钠）（Sodiumdodecylsulfate，SDS），裂解，KAc中和可以去掉大部分的蛋白质和RNA。Figure3.10Twoconformationofcirculardouble-strandedDNA.Twoconformationofcirculardouble-strandedDNAFigure3.11Plasmidpurificationbythealkal

8、inedenaturationmethod.Alkalinedenaturation2质粒DNA提取2.2EB—CsCl密度梯度离心法在大离心力条件下，形成梯度，生物大分子形成条带。条带的位置取决于其浮力密度。最上部是蛋白质，中间是DNA，下部是R