DB11T 819-2011 锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范

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1、ICS11.220B41备案号：31304-2011DB11北京市地方标准DB11/T819—2011锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范TechnicalprotocolfordiagnosisofKoiHerpesvirusDisease2011-08-09发布2011-12-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T819—2011前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由北京市农业局提出。本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。本标准由北京市农业局组织实施。本标准起草单位：北京市水产技术推广站。本标准主要起草人：王姝、徐立蒲、张振国、王静波、曹欢、贾丽、殷守仁。IDB11

2、/T819—2011锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范1范围本标准规定了锦鲤疱疹病毒病（KHVD）的样品要求、临床症状及流行病学特征、PCR检测、结果判定。本标准适用于锦鲤疱疹病毒病的诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。KHV：锦鲤疱疹病毒（Koiherpesvirus）KHVD：锦鲤疱疹病毒病（Koiherpesvirusdis

3、ease）PCR:聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleosidetriphosphate）4样品要求4.1水温采集样品时的水温应在16℃～32℃。4.2品种采样品种为锦鲤或鲤。4.3数量按照SC/T7103执行。4.4状态1DB11/T819—2011采集的样品不得腐败。4.5信息采集需采集鲤或锦鲤发病情况、混养其它鱼类发病情况、采样水温等信息。5锦鲤疱疹病毒病临床症状及流行病学特

4、征5.1患KHVD的锦鲤和鲤，具有下列临床症状：——最显著的特征为烂鳃,鳃出血并产生大量黏液,鳃丝溃烂；——体表出现苍白的块斑和水泡；鳍条和尾鳍充血；鳞片上出现血丝；——眼球凹陷；——口腔和腹部充血和出血。5.2患KHVD的锦鲤和鲤，具有下列流行病学特征：——混养池塘中,只有鲤或锦鲤（且不论大小）生病和死亡,而其它种类，如金鱼、草鱼等无此现象；——水温在18℃～30℃时,特别是在25℃～28℃时,鲤或锦鲤大量死亡,当水温升高或降低时,死亡现象下降或停止；——死亡极快，一条健康鱼从出现临床症状到死只有24h～48h；死亡率极高，疾病发生后在10天内,死亡率可达80%～100%。6PCR检测方法

5、6.1试剂和材料6.1.1水：符合GB/T6682—2008中一级水的规格。6.1.2KHV阳性核酸片断：由农业部指定机构提供。6.1.3Taq酶：－20℃保存，不能反复冻融或温度剧烈变化。6.1.4dNTP：10mmoL/L。6.1.5氯化镁溶液浓度：25mmoL/L。6.1.6扩增KHV的TK基因中的409bp片断的引物：浓度为100pmoL/μL。其序列如下：KHV-TK-F:5’-GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-3’；KHV-TK-R:5’-CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC-3’。6.1.7扩增KHV的Sph基因中292bp片断的引物：浓度为100pmoL/μ

6、L。其序列如下：KHV-Sph-F：5’-GAC-ACC-ACA-TCT-GCA-AGG-AG-3’；KHV-Sph-R：5’-GAC-ACA-TGT-TAC-AAT-GCT-CGC-3’。6.1.8DEPC水：用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水。6.2器材和设备6.2.1普通冰箱和超低温冰箱。6.2.2组织研磨器。2DB11/T819—20116.2.3离心机和离心管。6.2.4PCR扩增仪。6.2.5水平电泳仪。6.2.6微量移液器及吸头。6.2.7紫外观察灯或凝胶成像仪。6.3样品处理6.3.1体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm～6cm的鱼苗取内脏（包括肾），体长大于6cm的鱼

7、则取肾、脾、鳃；无临床症状的鱼，另外需加取肠和脑组织。6.3.2将所取样品匀浆成糊状，按1：10的最终稀释度悬于磷酸盐缓冲液（参见附录A.1）。6.3.3将450μL悬液放入1.5mL的离心管，再加入450μLCTAB溶液（参见附录A.2）并混匀，25℃作用2小时。6.4DNA抽提在含有样品的离心管中加入600μL抽提液Ⅰ（参见附录A.3），用力混合。12000r/min离心5min，取上层水相（约800μL