snt 1674-2011 锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１６７４—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１６７４—２００５锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犓狅犻犺犲狉狆犲狉狊狏犻狉狌狊犱犻狊犲犪狊犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜１６７４—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替了ＳＮ／Ｔ１６７４—２００５《锦鲤疱疹病毒分离和聚合酶链反应操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１６７４—２００５相比，主要技术变化如下：———修改了标准的名称；———增加了“病理变化观察”、“电镜观察”

2、及“间接免疫荧光（ＩＦＡＴ）”方法；———修改了原标准的ＰＣＲ方法。本标准修改采用国际兽疫局（ＯＩＥ）《水生动物疾病诊断手册》（２００９版）中第２．３．６章，主要修改如下：———原文中“Ｄｉｓｅａｓｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ”内容经修改简缩后作为本标准附录Ａ；———原文第５节内容删去；———原文格式及内容顺序排版上作了调整。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭明星、江育林、刘荭、陈建军、黄晟、罗志萍、朱堂明、赵晖。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———Ｓ

3、Ｎ／Ｔ１６７４—２００５。Ⅰ犛犖／犜１６７４—２０１１锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范１范围本标准规定了锦鲤疱疹病毒病诊断的临床症状、采样、间接免疫荧光、组织病理学观察、病毒分离、电镜观察、ＰＣＲ检测等检疫技术规范。本标准适用于进出境锦鲤疱疹病毒病的检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８出入境动物检疫采样３试剂和材料３．１锦鲤疱疹病毒（犓狅犻犺犲狉狆犲狊狏犻狉狌狊，ＫＨＶ）：标准毒株由ＯＩＥ参考实验室或国家质量监督检验检疫总

4、局指定的实验室提供。３．２细胞系：锦鲤鳍细胞（ＫＦ１）、脑组织（ＣＣＢ）细胞系由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。３．３引物３．３．１ＫＨＶ胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（ＴＫ）基因ＰＣＲ扩增引物序列：上游引物：５’ＧＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧ３’下游引物：５’ＣＡＣＣＣＡＧＴＡＧＡＴＴＡＴＧＣ３’扩增产物大小为４１０ｂｐ。３．３．２基于检测ＫＨＶＧｒａｙ犛狆犺基因建立ＰＣＲ方法的引物序列为：ＫＨＶＳｐｈＩ５Ｆ：５’ＧＡＣＡＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＧＧＡＧ３’ＫＨＶＳｐｈＩ５Ｒ：５’ＧＡＣＡＣＡＴＧＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＣＧＣ３’扩增产物大小为２９２ｂｐ。３

5、．４犜犪狇酶。３．５ｄＮＴＰｓ：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ。３．６无水乙醇：使用前预冷到－２０℃。３．７蛋白酶Ｋ。３．８ＤＮＡＭａｒｋｅｒ。３．９溴化乙锭。４器材和设备４．１ＰＣＲ扩增仪。４．２电泳仪及电泳槽。１犛犖／犜１６７４—２０１１４．３凝胶成像分析仪。４．４恒温培养箱。４．５高速冷冻离心机。４．６细胞培养瓶或培养板。４．７普通光学显微镜、倒置显微镜及电子显微镜。４．８切片机。５临床症状锦鲤疱疹病毒病（犓狅犻犺犲狉狆犲狊狏犻狉狌狊ｄｉｓｅａｓｅ，ＫＨＶＤ）是一种由锦鲤疱疹病毒引起的鲤鱼和锦鲤的高度传染性败血症疾病，主要临床表现为行动迟缓

6、，鱼眼凹陷，平衡失调，皮肤和鳃苍白、颜色不规则伴有中度至严重的鳃坏死，体表多黏液。该病的传染源为临床上被感染的鱼及隐性带毒鱼，临床症状同许多普通细菌与寄生虫感染的症状相似。患病鱼往往在１ｄ～２ｄ内即出现死亡（参见附录Ａ）。６采样６．１直接采样按照ＧＢ／Ｔ１８０８８采样，取鳃、肾、脾脏、脑等组织作为样品。６．２共同培养后取样通常用于检疫比较贵重的鱼，如比较名贵的锦鲤进出境展览检疫等。处理方法：将待检鱼与经检查没有感染ＫＨＶ的鲤鱼放在检疫隔离场于２３℃～２８℃下共同饲养２周～４周，按６．１的要求取鲤鱼样作为检疫样品。７检验方法７．１病理变化观察取鳃、肾、脾、肝组织制成病理切片，

7、在普通显微镜下观察组织细胞病理变化。典型ＫＨＶ感染可观察到鳃组织增生、次级鳃丝肥大融合、鳃上皮细胞的细胞核肿大并出现弥散性嗜酸性核内包涵体，肾、脾、肝实质细胞坏死。７．２电镜观察电子显微镜下进一步观察组织切片，ＫＨＶ感染的病鱼细胞中能看到弥散性嗜酸性核内包涵体，并可见到有疱疹病毒样粒子。７．３间接免疫荧光（犐犉犃犜）将待检鱼放血后，取其肾组织印迹于干净载玻片或者细胞培养皿，空气中风干２０ｍｉｎ，０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ｐＨ值７．２）冲洗一次，然后－２０℃预冷的丙酮或３０％＋丙酮７０％乙醇混合溶液轻轻