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《聚合酶链反应_PCR_方法与其它三种CMV抗体检测方法的比较》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、中国优生与遗传杂志2003年第11卷第2期29聚合酶链反应(PCR)方法与其它三种CMV抗体检测方法的比较高文英陈悦黄敬孚张桦佟彤(天津市儿童医院儿研所,300074)摘要:目的人类巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)可引起先天性感染,CMV感染所致疾病症状和体征等表现均是非特异性的,感染的病人不表现出任何临床症状,成为潜在感染状态,因而必须结合实验室诊断才能确诊。近年来发展起来并应用的各种检测CMV的实验室方法因有其各自的缺陷,而不能完全满足临床早期、快速诊断的需要。方法本研究应用PCR方法检测感染CMV患儿,同时与E
2、LISA检测CMV-IgM、CMV-IgA、CMV-IgG方法进行比较。结果经对491例临床怀疑为CMV感染的患儿进行实验,结果如下:PCR阳性率55180%,ELISAIgM阳性率8176%,ELISAIgA阳性率5150%,ELISAIgG阳性率68143%。结论通过实验进一步证实PCR方法是一种较敏感、快速的新的实验室方法,同时与其他三种目前应用较广泛的ELISA测定抗体方法进行了比较,指出PCR方法的优、缺点,对临床应用具有实际意义。关键词:聚合酶链反应(PCR);人类巨细胞病毒(CMV);儿童中图分类号:R512193文章标识
3、码:B文章编号:1006-9534(2003)02-0029-03人类巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)通过母体胎盘侵(200mMTris-HClpH=814,25mMKCl,20mMMgCl2,011%明袭胎儿,引起先天性感染。对于肾等器官移植、白血病、淋巴胶);200LMdNTPs;50pMPrimer1和Primer2;2Ll稀释后的Taq瘤等患者,可能因长期进行免疫抑制剂治疗,降低了肌体的DNA聚合酶(DNApolEB重蒸水=1B3),215U;10Ll处理好的免疫力,使体内隐伏的CMV被激活,引起全身感染,且
4、常伴血清标本或阳性对照、阴性对照,混匀后加入30Ll液体石有严重的肺炎和肝炎,甚至死亡。而CMV感染所致疾病症蜡。状和体征等表现均是非特异性的,而且许多CMV感染的病(4)PCR反应条件:人并不表现出任何临床症状,而成为潜在感染状态,因而必94e3min,60e1min,72e1min,1个循环变性;须结合实验室诊断才能确诊。近年来发展起来并应用的各94e1min,60e1min,72e1min,39个循环扩增;种检测CMV的实验室方法因有其各自的缺陷,而不能完全72e1min,30e1min,1个循环延伸,扩增产物进行115%[1-3
5、]满足临床早期、快速诊断的需要。我们应用PCR方法琼脂糖凝胶(015%EB)电泳(5V/cm,20min),紫外透射仪下检测CMV感染的患儿,同时与ELISA法检测CMV-IgM、观察结果,可见一263bp大小的荧光带即为阳性(以Pbr322CMV-IgA、CMV-IgG方法进行了比较,得出结论。DNA/HeaIIIMarker和Pbr322DNA/MspIMarker为核酸分子量标准,见图1),否则为阴性。资料与方法3.ELISACMV-IgM的检测方法:1.对象:自1998年2月至1999年7月,在我院住院治疗(1)标本的采集及处理
6、:取患儿静脉血110ml,及时分离临床上怀疑为CMV感染的患儿,年龄从出生115h的新生血清,置-20e保存至分析。儿,到13岁的儿童,共计491例,男性307例,女性184例。(2)试剂盒购自北京302医院病毒研究室。其中1岁以内婴儿436例,占总例数的88180%,大于1岁儿(3)方法:将抗人IgM包被液50Ll加入到酶标板孔内,童55例;6个月以内婴儿416例,占总例数的84173%,3个月37e,2h;洗涤3次。加入稀释的病人血清(1:20)50Ll,37e,以内婴儿389例,占总例数的79123%。30min;加入酶标记抗体、
7、抗原混合物50Ll,37e,30min。加入2.PCR方法:底物液A、B各50Ll,37e,2-5min,阳性结果为蓝色;加入中(1)标本的采集及处理:取患儿静脉血110ml,及时分离止反应液100Ll,阳性结果应由蓝色变为黄色。在酶标仪上血清,置-20e保存至分析;用时,取10Ll血清,与10Ll012M450nm处测定OD值。NaOH混合,37e水浴反应1h后,加入30Ll012MTris-HCl溶OD值COV为阳性;液混匀,取10Ll作为模板进行PCR扩增。COV=MNC+012@MPC;--(2)引物的设计与合成:MNC=(S
8、1+S2)/2;5c-GTGATCCGACTGGGCGAAAA-3c++MPC=(S1+S2)/2;5c-GAGCGCGTCCACAAAGTCTA-3cS1-为阴性对照其中一孔OD值;由宝生物工程(大连)有
