脂肪酶活检测原理及方法

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1、脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenylester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。2.所需试剂有：CAS碳链长度出货号价格名称830-03-5    C2    N8130-1G￥462    对硝基苯乙酸酯2635-54-9C4  N9876-1G  ￥570对硝基苯丁酸酯1956-10-1   C8    21742-1G-F￥487对硝基苯辛酸酯1956-1

2、1-2C12   61716-1G￥435对硝基苯月桂酸酯1492-30-4   C16N2752-1G￥379对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8   C18   N3627-1G  ￥2621.97对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma公司3.标准曲线绘制：a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol/L):称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。方法一：b.标准曲线绘制：分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16

3、ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。b.标准曲线的绘制：分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562

4、.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r/min，3min，测出标准曲线。上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm下测定吸光值,以1min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。公式y=14.474x+0.0272中x是p-NP的浓度(单位：mmol/l)，y是吸光值，14.474、0.0272是反应系数，R2是相关系数。则，酶活计算公式为：酶活=1000*n*V*(y-0.0272)/14.474t其中n为稀释倍数，t为反应时

5、间（单位：min），V为反应体系的总体积（单位：L）、1000是mmol到μmol的比例。二、底物耐碱性测定及试验液配制1.底物耐碱性测定a.6种底物分别加至pH7，pH8的37℃的PBS缓冲液中（选择37℃培养箱），每隔5min检测一次颜色变化，拍照；b.6种底物分别加至pH8，pH9的Tris-HCl缓冲液中（37℃），每隔5min检测一次颜色变化，拍照；c.分别加至pH9，pH10的Gly-NaOH缓冲液。2.测酶活所需要试剂的配制，酶活测定方法方法一：（96孔板法，粗略，速度快）a.溶液的配制溶液A：溶液A:30.0m

6、g对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP，Sigma，或者其他底物，337.52g/mol，即8.89*10-5mol)溶于10.00ml异丙醇（浓度为8.89*10-3M，或8.89mM），4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶500次测定；溶液B:缓冲液(pH缓冲液，可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100，混匀，4℃保存。96孔板（220μL）：A液（底物液）：18μL↗体系液180（μL）+酶液（40μL）↘B液（pH缓冲液）：162μL此步骤中，底物再次被稀释，浓度为0.889m

7、M。方法二：（吸光度法，精准，速度慢）a.溶液的配制溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP，Sigma，或者其他底物)溶于10.00ml异丙醇，4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶8-10次测定，或用于8-10个酶一次测定，或用于一个酶4次密精测定；溶液B:缓冲液(pH缓冲液，可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100，混匀，4℃保存。b.脂肪酶的活力测定（以单个酶液做一个/两个对照为例）①准备试管30个，10个15ml离心管；②取1ml/1.2ml溶液A加入到9ml/

8、10.8ml溶液B于离心管中，充分混匀，37℃水浴保温5min，分装至3/4个试管中，每个2.7ml，即体系液；③向每个试管中加入适量酶液（粗酶液加300μL），对照组中加入灭活酶液(沸水煮沸5min)，加入酶液后即为反应液；④37℃反应10-15min，加入95%乙醇终止反