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时间:2019-06-19
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1、脂肪酶活检测原理及实际方法:一、原理以及标准曲线做法1.对硝基苯酚酯(4-Nitrophenylester)是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物,脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色,在410nm下有吸光值,且灵敏度很高。2.所需试剂有:CAS碳链长度出货号价格名称830-03-5 C2 N8130-1G¥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9C4 N9876-1G ¥570对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F¥487对硝基苯辛酸酯1956-1
2、1-2C12 61716-1G¥435对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16N2752-1G¥379对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ¥2621.97对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂,购于sigma公司3.标准曲线绘制:a.标准对硝基苯酚母液(2mM,2mmol/L):称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B(即不同pH的缓冲液),置于棕色试剂瓶内,4℃冰箱保存。方法一:b.标准曲线绘制:分别取0.02,0.04,0.06,0.08,0.12,0.16
3、ml的对硝基苯酚母液(2mM),用溶液B(即不同pH的缓冲液)稀释至4ml,分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是0.01,0.02,0.03,0.04,0.06,0.08,单位:mM)为横坐标,吸光值y为纵坐标,绘制标准曲线。方法二:全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理,获得吸光度。b.标准曲线的绘制:分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和(全部都是)562
4、.5的溶液B,40℃15min,95%乙醇,10000r/min,3min,测出标准曲线。上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义:在410nm下测定吸光值,以1min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。公式y=14.474x+0.0272中x是p-NP的浓度(单位:mmol/l),y是吸光值,14.474、0.0272是反应系数,R2是相关系数。则,酶活计算公式为:酶活=1000*n*V*(y-0.0272)/14.474t其中n为稀释倍数,t为反应时
5、间(单位:min),V为反应体系的总体积(单位:L)、1000是mmol到μmol的比例。二、底物耐碱性测定及试验液配制1.底物耐碱性测定a.6种底物分别加至pH7,pH8的37℃的PBS缓冲液中(选择37℃培养箱),每隔5min检测一次颜色变化,拍照;b.6种底物分别加至pH8,pH9的Tris-HCl缓冲液中(37℃),每隔5min检测一次颜色变化,拍照;c.分别加至pH9,pH10的Gly-NaOH缓冲液。2.测酶活所需要试剂的配制,酶活测定方法方法一:(96孔板法,粗略,速度快)a.溶液的配制溶液A:溶液A:30.0m
6、g对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP,Sigma,或者其他底物,337.52g/mol,即8.89*10-5mol)溶于10.00ml异丙醇(浓度为8.89*10-3M,或8.89mM),4℃棕色瓶(可以使用包锡箔纸的15ml离心管)保存,每10ml可用于单个酶500次测定;溶液B:缓冲液(pH缓冲液,可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100,混匀,4℃保存。96孔板(220μL):A液(底物液):18μL↗体系液180(μL)+酶液(40μL)↘B液(pH缓冲液):162μL此步骤中,底物再次被稀释,浓度为0.889m
7、M。方法二:(吸光度法,精准,速度慢)a.溶液的配制溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP,Sigma,或者其他底物)溶于10.00ml异丙醇,4℃棕色瓶(可以使用包锡箔纸的15ml离心管)保存,每10ml可用于单个酶8-10次测定,或用于8-10个酶一次测定,或用于一个酶4次密精测定;溶液B:缓冲液(pH缓冲液,可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100,混匀,4℃保存。b.脂肪酶的活力测定(以单个酶液做一个/两个对照为例)①准备试管30个,10个15ml离心管;②取1ml/1.2ml溶液A加入到9ml/
8、10.8ml溶液B于离心管中,充分混匀,37℃水浴保温5min,分装至3/4个试管中,每个2.7ml,即体系液;③向每个试管中加入适量酶液(粗酶液加300μL),对照组中加入灭活酶液(沸水煮沸5min),加入酶液后即为反应液;④37℃反应10-15min,加入95%乙醇终止反
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