2015年分子生物学--2基因重组和转座

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1、分子生物学MolecularBiology生命科学与农学学院王雪芹Email:wangxueqin0218@163.comTel:18348372680周口师范学院生命科学与农学学院第六章DNA的重组与转座DNArecombinationandTransposition同源重组（homologousrecombination)位点特异性重组(site-specificrecombination)转座作用(transposition)发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称普遍性重组、基本重组

2、，是最基本的DNA重组方式。通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。第一节同源重组利用DNA序列同源性来识别重组对象蛋白质因子紧紧帮助它们同源识别。只要两条DNA序列相同或接近，就可以在序列中的任何一点发生同源重组。同源重组存在热点（hotspot）即某类型序列发生重组的概率高于其他序列。同源重组要求序列同源性的最低长度因不同机体而异，一般在25~300bp之间。同源重组的特征：同源重组发生在减数分裂同源染色体非姊妹染色单体之间，是一种交互重组类型。但在细菌转化、结合和普遍性转导中，同源重组是一种单向重组类

3、型，仅受体DNA发生改变，而供体DNA并未发生变化。一、同源重组的分子机制1.同源重组的基本条件在交换区具有相同或相似序列双链DNA分子间互补配对重组酶同源重组需要一些蛋白质因子（如大肠杆菌的RecA、B、C、D）及酶（如DNA连接酶）等。异源双链区的形成2.同源重组的分子模型——Holliday模型此模型中，同源重组主要有4个关键步骤：①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，

4、分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)Holliday中间体Holiday重组模型(双链侵入模型）Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体二、同源重组的酶学机制大肠杆菌重组有关的酶：RecA：诱发SOS反应和促进DNA单链的同化(

5、assimilation)。单链同化即是指单链与同源双链分子发生链的交换，从而使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得以产生。RecA蛋白介导的DNA链交换模型A:DNA链交换的侧面观:1.RecA蛋白与单链DNA结合；2.复合物与同源双链DNA结合；3.入侵单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来;B:DNA链交换过程RecA蛋白的横切面2.RecBCD酶：产生参与重组的DNA单链该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码。RecBCD酶具有三种酶活性：①依赖于ATP的核酸外切酶活性，②可被AT

6、P增强的核酸内切酶活性，③ATP依赖的解螺旋酶活性。当DNA分子断裂时，它即结合在其游离端，使DNA双链解旋并降解，解旋所需能量由ATP水解供给。及至酶移动到chi位点(5′GCTGGTGG3′)，在其3′侧4～6个核苷酸处将链切开，产生具有3′末端的游离单链。随后单链可参与重组各步骤。大肠杆菌基因组共有1009个chi位点，分布在DNA各部位，平均5kb有一个，成为重组热点。3.RuvABC:产生促进异源双链的形成和切开Holliday联结体。RuvA蛋白能够识别Holliday联结体的交叉点，RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象，使

7、分支点易于移动。RuvA帮助RuvB六聚体环结合在双链DNA上。RuvC是一种核酸内切酶，特异识别Holliday联结体并将其切开。RuvAB复合物结合于Holliday联结体的模型转化transformation接合conjugation转导transduction细胞融合cellfusion三、细菌同源重组1.细菌转化通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞(competentcell)。有些细菌

8、在自然条件下不发生转化或转化效率很低，但在实验室中可以人工促使转化。例如大肠杆菌，用高浓度Ca2+处理，可诱导细胞成为感受态，重组质粒得以高效转化。人工转化的机制目前还不十分清楚