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1、编号实验类型综合性试验成绩生物学综合实验ComprehensiveExperimentofBiology论文题目Pfu酶的表达，纯化及功能分析作者姓名任佳学号2010114010117所在院系生命科学学院学科专业名称生物科学导师王友如论文完成时间2013年03月02日4Pfu酶的表达，纯化及其功能分析任佳指导老师：王友如（湖北师范学院生命科学学院，生物科学1001班，湖北，黄石435002）摘要：目的：利用重组大肠杆菌DH5α表达pfu酶，并对其功能进行分析。方法：含pfuDNA聚合酶基因的重组大肠杆
2、菌DH5α。经1mMIPTG诱导表达10-12小时后,用超声波破壁，再用用80℃,30min热变性去除部分杂蛋白,粗酶液经Ni离子亲和层析进一步纯化。最后用PCR检验酶的活性。结果：获得了高纯度的重组pfu酶,并发现其具有较高的活性，利用该酶成功扩增出VHB的DNA片段。关键词：pfuDNA聚合酶；IPTG诱导；纯化；活性。Expression,purificationandfunctionresearchofpfuDNApolymeraseRenJiaTutor:WangYouru(Collegeo
3、fLifeScience,HubeiNormalUniversity,Huangshi,HubeiProvince))Abstact:Aim：ExpresspfuDNApolymeraseinE.ColiDH5α，thenpurifyitandresearchitsfunction.Method:E.ColiDH5αcontainingpfuDNApolymerasesgene,10-12hafter1mMIPTGaddition,werewall-brokenbyultrasonicwave.The
4、extractionwerepurifiedbyheattreatment(80℃，30mintodenatureE.Coliproteins),followedbymetal-affinitychromatographyon4Ni2+-Sepharosecolumns.Conclude:WegotpfuDNApolymeraseafterpurification,thenfoundthattheenzymeswerecharacterizedanddisplayedhighDNApolymerase
5、activity.WeuseitsuccessfullyinamplificationofVHBgene.Keywords：PfuDNApolymerases；IPTGaddition；Purification；Activity.PfuDNA聚合酶是从超高温古生菌强烈炽热球菌(Pyrococcusfuriosus)中分离得到的，拥有3′→5′外切酶活性,这使它在PCR扩增过程中能够校正错误,是已知DNA聚合酶中出错率最低的,特别适用于需要高保真度的PCR扩增[1]，被认为有潜力取代目前广泛使用的Taq
6、酶。Pyrococcusfuiosus最早是在意大利Vulcano地热海底沉淀物中发现的。PfuDNA聚合酶基因编码一个775个氨基酸的多肽,分子量90,109D。这种酶最初是直接从Pyrococcusfuiosus中分离得到的,但因这种极端嗜热的厌氧菌很难培养,难以获取大量的酶。本项目通过修饰引物使Pfu基因末端引入His-tag编码序列，从已有Pfu基因的载体上把它克隆下来，重新连接入更易表达的pET-28a载体中，并在大肠杆菌DH5α中大量表达，通过纯化使其与商用Pfu酶活性相当并对其功能做具体
7、研究，发现其具有较高的活性。4目录1.前言12材料与方法22.1材料22.1.1实验材料22.1.2仪器设备22.1.3试剂及溶液32.2方法72.2.1Pfu酶的表达…………………………………………………….72.2.2目的蛋白的纯化103结果与分析133.1SDS-PAGE电泳结果分析143.2PCR结果分析144讨论165总结…………………………………………………………………………..165.1纯化过程中可能出现的问题…………………………………………175.2PCR过程中可能出现的问题176参考
8、文献17致谢184湖北师范学院2012年生命科学学院本科综合性实验论文Pfu酶的表达，纯化及其功能分析任佳指导老师：王友如（湖北师范学院生命科学学院，生物科学1001班，湖北，黄石435002）1.前言.Pfu最初是直接从Pyrococcusfuriosus中提取出来的[2][3]，但是这种嗜热性厌氧菌很难生长到一定的规模而获得大量这种蛋白质酶，所以在杆菌中表达重组的Pfu酶是一个较好的选择。Lu和Erickson[3]利用pET载体，成功的在大肠杆菌中
