肝糖原的提取,定性以及定量实验

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1、生物化学实验报告姓名：张子荣学号：3150901080专业年级：2015级临床医学组别：第五实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖元的提取，鉴定和定量检测实验日期2016.12.29实验地点第五实验室合作者张林燕指导老师何肖娟评分教师签名批改日期格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1.掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。3.正确

2、操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4.熟练运用溶液混匀的各种方法。5.正确掌握溶液转移的操作。6.正确操作使用分光光度计。二、实验原理1.肝糖原的提取糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。2.糖原的鉴定糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定

3、肝组织中糖原的的存在。CuSO4+2NaOH=Na2SO4+Cu(OH)22Cu(OH)2+C6H12O6=2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O2CuOH=H20+Cu2O(红色)Cu(OH)2====H2O+CuO(黑色)3.肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10—100mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定

4、，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。三、材料与方法：以流程图示意仪器及试剂：1.仪器：（1）普通离心机，室温-100℃恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，精度为10mg级电子天平（2）剪刀、镊子、研钵（3）试管架，离心管，试管（4）刻度吸量管（2ml,5ml），1000μl微量可调取液器（5）100ml容量瓶（6）白瓷反应板2.试剂：鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/LNaCl溶液、浓HCl、12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）蒽酮显色剂实

5、验方法及步骤：1.肝糖原的提取鸡肝约1.5g，剪碎＋5%CCl3COOH1ml研磨至乳状＋5%CCl3COOH3ml研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心3分钟（4000r/min）沉淀（弃去）上清（取3.5-3.8ml）＋等量的95%乙醇，混匀，静置10分钟离心5分钟（4000r/min）上清（弃去）沉淀＋蒸镏水1ml沸水浴2分钟，溶解沉淀白瓷板孔穴中糖原溶液1ml＋浓HCl5滴（250微升）加碘试剂2滴加碘试剂2滴沸水浴15分钟，冷却糖原溶液2滴＋50%NaOH5滴（250微升）呈色对比糖原水解液2滴（100微升）糖原水解液＋班氏试剂4滴（200微升）混匀沸水浴2分钟，观察变化注意

6、事项：1、提取肝糖原时，向上清液中加入等量的95%乙醇后，必须混匀。由于上清液为水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成两层。加之上清液已4ml多，加上等量乙醇，总量接近9ml，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。2、糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20-30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分支链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下（通常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。3、糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应

7、有的结果。2.肝糖原定量测定鸡肝0.15g+30%KOH1.5ml沸水浴15min冷却，全部转入100ml容量瓶中加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液取3支干净的试管，按下表操作：试剂（ml）空白管标准管样品管蒸馏水1.0————标准葡萄糖溶液——1.0——糖原提取液————1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5混匀，沸水浴10min，冷却。在722型或721型分光光度计620nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）.计算：肝糖原（g/100g肝组织