蛋白酪氨酸磷酸酶B的缺陷抵抗TGFβ在肝细胞中引起的抑制作用

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1、蛋白酪氨酸磷酸酶1B的缺陷抵抗TGF-β在肝细胞中引起的抑制作用2110430何顺漪目的研究PTP1B在对TGF-β进行细胞应答过程中的作用意义对研究磷酸酶在TGF-β信号通路中的作用开拓了新思路简介实验相关技术实验过程及结果结论内容简介在肝脏中，转化生长因子β(TGF-β）是一种重要的调节细胞因子。它在调节肝细胞的增殖和死亡过程中发挥重要作用。然而，TGF-β也可调节形成肿瘤的过程，例如，上皮细胞向间叶细胞的转变，此过程可导致细胞迁移、生存、细胞入侵，免疫调节或微环境的调节。TGF-β最终的作用是通过生存信号的活化而被调节，这些信号依赖于不同的蛋白激酶，例如，表皮生长因子受体

2、（EGFR）或Ras/ERK途径。这些激酶通常是通过蛋白磷酸酶将其磷酸化来调节。在这些酶中，蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是无受体PTP中能广泛表达的一员，主要位于有细胞内膜的细胞器中，如内质网。它的缺乏可抵抗由不同刺激物引起的细胞死亡。TGF-β信号途径中涉及到的酶活性氧组分（ROS）NADPH氧化酶(NOX)PTP1BNF-κBTGF-βNOX1实验方法1、细胞培养------DEME2、细胞数量分析-------crystalvioletstaining3、细胞周期的分析------flowcytometry4、细胞增殖的测量------[3H]-thymidine5

3、、细胞内氧化还原状态的测量—氧化作用敏感的荧光探针6、分析凋亡的细胞核实验方法7、caspase-3活性的分析8、基因表达的分析—semiquantitativePCRRealTimePCR9、蛋白印迹10、免疫细胞化学研究11、沉默实验分析-----siRNAreal-timequantitativePCR指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。应用：1.DNA或RNA的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。2.基

4、因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。3.基因分型：例如SNP检测，甲基化检测等。常用方法SYBRgreen:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。TaqmanProbe:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基

5、团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。实验过程及结果为了研究PTP1B在TGF-β信号途径中的作用，首先比较野生型和缺陷型细胞中几种激酶的基本活性。对照ERK：细胞外调节蛋白激酶，将信号从表面受体传至核内，参与细胞增殖分化、细胞凋亡等。AKT：是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用。结果：缺陷型细胞的ERK和AKT磷酸化水平较高

6、实验过程及结果野生型和缺陷型细胞对TGF-β应答进行比较结晶紫染色结果：经36h处理后，野生型细胞数量减少，缺陷型细胞数量没有变化实验过程及结果据报道，经TGF-β处理后细胞数量减少是由于细胞凋亡和生长抑制的组合效应，所以测定它在应答细胞因子过程中的作用。结果：野生型细胞中TGF-β能够抑制EGF诱导的DNA合成。EGF：表皮生长因子实验过程及结果测定caspase3的活性，研究细胞凋亡情况。小结：缺陷型肝细胞能够抵制TGF-β的抑制作用，如：生长抑制细胞凋亡。实验过程及结果考虑到PTP1B缺乏的肝细胞能够抵制TGF-β的作用，对参与细胞因子信号传导过程的分子进行研究。首先，证

7、明这些肝细胞能够表达所有参与TGF-β介导的信号传导过程的蛋白，如，受体，smad蛋白。实验过程及结果对照RT-PCR实验过程及结果检测smad2和smad3磷酸化水平totalNuclearextracts结果：缺陷型细胞中两者均减少。实验过程及结果结果：磷酸化的Smads转移至核中的量减少。DAPI染色染色原理：4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整