超级感受态E.coli细胞制备

《超级感受态E.coli细胞制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、大肠杆菌（E.coli）超级感受态细胞制备H.Inoue,H.Nojima,andH.Okayama(1990)HighefficiencytransformationofEscherichiacoliwithplasmids.Gene96:23-28溶液：SOB培养基1L500ml10002％Bactotryptone20g10g0.5%yeastexctract5g2.5g10mMNaCl0.6g/L0.3g2.5mmKCl0.18g/L250mM5ml10ml10mMMgCl22.03g/l..6H2O2M2.5ml5ml10mMMg

2、SO42.46g/l..7H2O1M10ml20ml培养细菌用。TBbuffer(transformationbuffer):10mMHepes(orPipes)2.5g/lHepes15mMCaCl22.27g/l(.2H2O)250mMKCl18.6g/l55mMMnCl210g/l除MnCl2外，所有组分以固体加水中溶解和搅拌混匀，并以KOH调pH6.7，再将MnCl2溶解上述溶液中，用0.45μm滤膜抽滤除菌，存放于4℃备用。4℃预冷所需的器皿：离心机转子、移液管、枪尖和eppendorf管。步骤：1，取5mlSOB加到100ml的

3、小烧瓶中，从新培养的平板上接种一个单克隆。过夜培养。2，在一个2L的烧瓶中加200mlSOB，接种预培养的菌液1ml。在18℃，置于摇床剧烈振荡（200-250rpm）培养至OD660=0.6，大约需要1.5-2天。（注：下面所有处理应该在低温下操作）3，将培养物和低温离心管放置冰中，10min，将培养物转到预冷的离心管中。4，离心收集：4℃、3000rpm、10min。去上清，倒置于面纸上。加原体积1/3（17ml）的冷的TBbuffer，冰上冷浴10min。5，离心收集：4℃、3000rpm，10min。去上清，倒置于面纸上。小心地将细

4、胞重新悬浮于原体积1/12（4ml）的冷TBbuffer。再加DMSO280μl，轻旋振，置冰上10min。6，分装细胞悬浮液，每200μl为单位加到预冷的eppendorf管中，立刻放于液氮中冷冻。67，取出，存放于-80℃。至少可存放1个月而无明显的效率下降。备注：1，感受态细胞脆弱易碎，其细胞壁具缝，因此在准备中需要轻柔操作，不可剧烈振荡或以移液管吸取吹打来悬浮细胞。离心时也不可转速过大，5000g可以引起细胞裂解。2，制备过程中，总是保持细胞低温冷却，不能使温度上升。3，液氮冷冻可以使感受态细胞转化效率明显高一些。5，此法不适于BL

5、21菌株，因此用BL21菌株制备感受态细胞时的培养温度应该是30或37度。有证据显示，以Inoue方法制作的感受态效率可以用下面的处理得以提高：在冷冻之前，用DTT加以处理（加3.5％v/v2.2MDTT，10mMKAcpH6溶液，然后置于冰冷浴10min）。6，热休克时间因菌株而异。DH5α或JM109取30-45sec，而BL21取120sec。7，在转化前，要降低连接酶的活性。连接酶可以降低转化效率。8，稀释连接体系的浓度（-5x）也可以提高转化效率，因为降低了可能影响转化的试剂的浓度。同样，建议苯酚/氯仿处理，也可以提高转化效率，但

6、是会使得步骤繁琐。9，所加DNA不得多于感受态细胞量的5％，其终浓度不得超过5ng/ul。10，上述方法可产生的转化效率达到1μgpUC质粒转化到108个单克隆，甚至109。11，转化效率与质粒大小有个粗略的反比例关系。具有deoR突变基因的细胞（DH5α）可以提高对于大质粒的转化效率，非严谨质粒转化效率约为超螺旋的3/4左右。12，可以同时用两个不同的质粒来做转化，或先后转化。但他们必须是兼容的，不能具有相同的复制子。13，对于常规的转化，转化效率并不重要，某些步骤可以简化或省略。如热休克就不是必需的，37度恢复孵育时间就可以缩短或省略

7、（注：这依赖于用来筛选所用的抗生素，如氨苄青霉素，孵育时间就无所谓了，如果乐意就可以在热休克后直接涂平板；但对于别的抗生素而言，孵育时间是基本步骤）。14，细胞涂布平板于干的1.5％琼脂糖平板，使用前先将之倒置放于37度2-4hr晾干，使得可以吸收1ml左右液体培养基。对于蓝-白斑筛选，不必制作X-gal平板，就直接加X-gal+IPTG到细胞中混匀了再涂布平板。15，去污剂会损害感受态细胞的转化率，所以用来制作感受态细胞的玻璃器皿等不能用去污剂洗涤。聚碳酸酯烧瓶也可以用来代替玻璃瓶，DMSO会溶解聚苯乙烯，所以使用聚丙烯管子。16，如果克

8、隆困难，只有不稳定的测序结果（如回文序列、重复片段。LTR序列），它将有助于生长出转化子，在较低温度下（25-30度或室温）在非常丰富的培养基中（如TerrificBroth）。