《ChIP实验》PPT课件

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1、黄文锋文献汇报之染色质免疫沉淀（ChIP）技术及其应用2009年7月27日主要内容何谓ChIP实验技术ChIP技术基本步骤及注意事项ChIP实验技术的应用何谓ChIP实验技术染色质免疫沉淀技术（ChromatinImmunoprecipitation，简称ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的重要方法。是深入分析癌症，心血管等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。何谓ChIP实验技术在生理

2、状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理，将染色质切成小段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白原理质与DNA相互作用的信息。何谓ChIP实验技术主要内容何谓ChIP实验技术ChIP技术基本步骤及注意事项ChIP实验技术的应用ChIP技术的基本步骤基本步骤优秀幻灯片DNA的分析鉴定染色质的断裂细胞的固定染色质免疫沉淀交联反应的逆转及DNA的纯化细胞的固定交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。ChIP实验利用甲醛在生理状态

3、下使蛋白质-DNA交联，形成生物复合体，避免了DNA结合蛋白在染色质上的重新定位，或者在后续的生化分离中丢失。甲醛是一种高分辨率的可逆的交联剂染色质结构本身是动态的，并且DNA与非组蛋白相互作用常是瞬时的。注意事项交联时间过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响实验结果。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。ChIP技术的基本步骤基本步骤优秀幻灯片DNA的分析鉴定染色质的断裂细胞的固定染色质免疫沉淀交联反应的逆转及DNA的纯化染色质的断裂超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而

4、影响ChIP的效率。交联后的染色质可被超声波切成400~600bp的片段（用琼脂糖凝胶电泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。注意事项在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。ChIP技术的基本步骤基本步骤优秀幻灯片DNA的分析鉴定染色质的断裂细胞的固定染色质免疫沉淀交联反应的逆转及DNA的纯化染色质免疫沉淀Input对照Beads选择抗体的选择阳性与阴性对照Input对照Input对照可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Inp

5、ut中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率。在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。必不可少的步骤染色质免疫沉淀Input对照Beads选择抗体的选择阳性与阴性对照Beads选择Magnabeads是近年来出现的一种新型beads，它使用方便，不像Agarosebeads那样容易破裂，所以在操作过程中更简单，而且免去了离心的步骤，节省不少时间。Millipore公司最新推出的

6、MagnaChIP试剂盒就是采用这种Magnabeads。利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物，然后使用Agarosebeads（琼脂糖小球）或Magnabeads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质后，用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。染色质免疫沉淀Input对照Beads选择抗体的选择阳性与阴性对照抗体的选择因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP

7、的结果。不是所有的抗体都能做ChIP实验的，只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性，实验成功的关键染色质免疫沉淀Input对照Beads选择抗体的选择阳性与阴性对照阳性和阴性对照阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，常用的包括组蛋白抗体或RNAPolymeraseII抗体等。目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较，才能得出正确结论。没有对照就很难对实验结果的可靠性进行评估，所以实验对照显得尤为重要。阳性与阴性对照还应考虑目的蛋白

8、抗体与DNA的非特异性结合的可能，所以通常还会选择一对阴性引物，即