chip实验流程

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1、操作要点二、技术总结（一）、关于细胞细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态莨接影响细胞内部的基因表达调控M络，也很有口丁能影响你所研究的TF与典靶Promoter的結合。一般细胞长到75%—80%比较好。（二）、关于抗体！抗体是实验成败的致命W素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽撒买人厂的抗体。不推荐国产抗体和santacruz的抗体，即使是IP级别的。中.抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。似足肀抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合拊

2、被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没冇这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。（三）、关于交联与超声破碎！这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因纟II打碎成小片段。交联不充分，只有一部分靶蛋D与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的不尚，实验假明性。交联过充分，葙因组上结合Z太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。：W外也会增加背景。一般來讲，按照我的经验，交联条件取

3、决于细胞类型。不的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH-3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min,1%的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的祌器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟丫。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp-1000bpo但是200bp-2000bp的范围也是可以接受的。（四）、关于操作希望尽可能的保持低温（4度）。沉淀的吋候可以先在4度放置一会，等它然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。虽然说明K上说ChIP实验的过程

4、中冇几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出來为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。（五）、关于解交联里然说明15I•.说4小吋己经足够，但是我还是希塑你可以解交联过夜。因为/十:那样的环境里,DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管L1封上封口膜。（六）、关于DNA片段的回收需要注意的足：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS,影响PCR实验结果。小Tip:过柱前，在样品中加入一定景的异丙醇，能柯效的消除SDS沉淀。另外还有一些，一吋想不起來。以后慢慢补充吧。与

5、EMSA相比，优势就是直接研究了体内的情况。EMSA,并不能真实地模拟体内的环境，蛋白分子和核酸分子的浓度也发牛.变化了，更不用说蛋白分子和核酸分子在细胞内的定位I'uJ题。"所谓的EMSA,实就是在体外，将某一种核酸和某一种蛋內浞合在一起，然P看它们是否能相互结合。但是众所周知，体外环境和体内环境是完全不同的。很有可能在体内，这种核酸和这种蛋白山于细胞区域定位的问题，根本不会相遇，也根本不会有结合的事情发生。但是在体外，当它们相遇时，它们却能结合。也有可能在体A，这种核酸和蛋白的浓度相当的低，在这样低浓度的状况卜，它们不会结合。似足在体外EMSA实验中，

6、核酸和蛋白的浓度都增加了好儿十倍。导致反应向阳性的方向进行，这种情况又该如何解释？所以EMSA结果阳性，是能结合的必要条件，但却不是充分条件。〃ChIP结合realtime—PCR,基本上还是能相对真实的反映细胞内部转呆因子和6动子的结合。但是具体问题具体分析。三、实验设计这里只说说实验各组的作用l.input：样本经过超声，但是没有进行ChIP，包含样本超声后总DNA,可以进行电泳，检测超声效果，同时，可以与蛣后ChIP样木进行比较，看ChIP的效率（如果用同一引物进行PCR，ChIP组和input组亮度差不多，说明ChIP效率高，基木上，样木屮所有的U

7、的基W片段都被ChipK來了，反之，说明效率低，实验条件有待改进）2、阳性对照:一般用anti-RNAPolymeraseII抗体，因为RNAPolymeraseII是通用转录因子，在所柯细胞屮都能结合基因（当然是在该细胞屮表达的基因，所以为了保证阳性对照有效,—般选择阳性对照的引物是根裾管家难因设计的）的核心启动T区，因此，理论上ChIP盾PCR都会有条带3、阴性对照：用普通的IgG做为抗体，理论上不会ChIP下來任何DNA片段，因此作为阳性对照，但是由于非特异结合，或者实验过程中，没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现条带，个人认为这组最理想的结果

8、当然是没柯条带，但是如果有一条淡淡的条带（与阳性对照和H的基因组相