microbial-genetics3细菌和放线菌的基因重组和遗传分析

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1、第三章细菌和放线菌的基因重组和遗传分析真核微生物：基因重组涉及整个染色体减数分裂原核生物：基因重组仅涉及部分染色体或个别基因转化、接合、转导第一节转化作用（Transformation）转化：某一基因型细胞从周围介质中吸收来自另一基因型细胞DNA而使受体细胞基因型和表型发生相应变化的现象。A.TransformationTransferoffreeDNAtoabacterialgenome.freeDNAfreeDNArecipientcellgeneralrecombination一般重组(同源重组)Transformant转化子chromosomeGeneralrecombinat

2、ionisnotnecessarybecauseplasmidshaveoriginsofreplicationtransformantfreeDNA(plasmid)TBGriffithin1928,肺炎双球菌转化现象自然转化的原核生物种类大肠杆菌肺炎双球菌枯草芽孢杆菌流感嗜血菌一、转化作用的发现Griffith转化研究(1928)二、转化作用过程1、受体细胞感受态出现2、转化因子的吸附和渗入3、转化因子的整合1、感受态出现感受态(Competence)：细菌从周围环境吸收DNA分子，并且不易被细胞内的限制性内切酶分解时所处的一种特殊生理状态。处于感受态的细胞转化率高Competen

3、ce:ThecapacityofcellstotakeupfreeDNAa.Somecellsarenaturallycompetentb.Insomecells,competencecanbeinducedbychemicalandphysicaltreatmentc.Inmostcells,competencecanbeinducedbyelectroporation.TB感受态：在特定生长阶段或特定条件下出现，一般出现在细胞对数期后；不同细胞维持感受态时间不同；实验：肺炎双球菌抗链霉素菌株DNA转化无抗性菌株感受态诱导如果细胞没处于感受态可以诱导：①细胞由营养丰富的培养液→贫瘠的

4、培养液②高浓度CaCl2和改变温度结合处理：适合于独立的DNA复制子，如质粒和病毒，转化率很高。对数生长期的大肠杆菌(受体菌)悬浮于冰预冷的低渗0.1mol/L氯化钙溶液中处理15-30min使细菌细胞膜通透性增加（成为感受态细胞）向大肠杆菌中加入外源DNA，使之吸附于细胞表面42℃短暂的热处理，促进外源DNA进入感受态细胞.感受态诱导(实验)③对于不能自然形成感受态的细胞，可以采用PEG（聚乙二醇）诱导转化,这类细菌首先用细胞壁降解酶除去肽聚糖层，在PEG存在下，质粒和噬菌体DNA可以高效导入原生质体。---例如：Bacillussubtilis利用PEG技术可以使80%

5、的细胞被转化，107转化子ug质粒DNA。④对于不能自然形成感受态的细胞，也不能诱导产生感受态的细胞，可以用人工方法将核酸导入电击穿孔转化：用电转化仪产生的高压脉冲电流击穿细胞膜形成小孔，使DNA分子通过小孔瞬间进入细胞。小孔自动恢复原状.该法适合于原核细胞和真核细胞。对于大肠杆菌，109-1010转化子ugDNA.电转化仪（转化细菌和真菌）3)TransformationApplication:RecombinantDNAtechnology电击杯利用高压气体加速，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的受体细胞中。He利用Genegun转化DNA二、转化作用过程1、受

6、体细胞感受态出现2、转化因子的吸附和渗入3、转化因子的整合2、转化因子的吸附和渗入转化因子(线形)首先吸附在感受态细胞表面凹陷处，由核酸内切酶作用将DNA切成4-5MD的片段，再由核酸外切酶作用将双链的一个单链分解，另一单链与感受态特异蛋白结合，进入细胞。感受态特异蛋白细胞分泌小蛋白,而导致细菌感受态的形成,在营养缺乏的饥饿状态下，细胞易产生感受态因子在自然转化中感受态因子与细胞表面受体相互作用产生自溶素，自溶素可使细胞表面的DNA结合蛋白和核酸酶裸露。核酸酶可完全降解DNA，所以自然转化很难发生。3、转化因子整合1）受体DNA部分双链松开，供体和受体DNA单链碱基配对2）供体DNA整

7、合于受体染色体上，与之配对的受体DNA单链被DNA酶降解3）不与供体DNA配对的另一条受体DNA单链被切下降解4）供体DNA单链复制成双链细菌转化三、转化在遗传分析中的应用1、基因连锁检测实验：肺炎双球菌R/Amps（受体）和S/Ampr型（供体）进行转化。S/AmprDNA+R/Amps→R/AmprorS/AmpS说明每次转化,受体菌只能得到供体菌某一形状.共转化：受体菌吸收外源DNA后，两个遗传形状同时改变的现象。共转化的两个基因可以是连