C00微生物学实验基本操作与培训

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1、微生物基本实验操作技能要领及注意事项一、无菌操作1、无菌概念：什么地方是有菌的，什么地方是无菌的；哪些地方要求基本无菌，哪些地方严格要求无菌。2、操作环境：实验室；接种箱；超净工作台；无菌工作室。3、工作范围：接种、转管、倒平板、梯度稀释、涂平板、平板划线、菌体(菌悬液)转移及其他需要无菌操作的实验环节。一、无菌操作4、要领及注意事项：（以实验室接种、转管为例）（1）斜面、接种环拿法；（2）火焰保护；（3）接种环灭菌；（4）接种环冷却及轻快接触斜面；（5）棉塞的制作及处理。二、染色、制片1、类型：分装片和涂片；2、操作步骤：（以涂片为例）1）涂片：载玻片---滴加生理

2、盐水---挑菌涂成薄膜；2）干燥：室温自然干燥：3）固定：菌面向上，火焰上过2-3次：4）染色：滴加染色液（美蓝）,覆盖（2-3分钟）；5）水洗：自来水冲洗，至基本无色，晾干；6）镜检：调节光源，低倍镜观察，高倍镜观察，油镜观察。二、染色、制片4、要领及注意事项：（1）生理盐水和菌体一定不能过多；（2）菌膜不能过厚，最好细胞分布疏密相间；（3）固定要到位，不能残留水，也不能固定过度；（4）染色时间正确，一定要按规定计时；（5）水洗时，水流不宜过急；（6）镜检前片子一定要干燥无水。三、油镜头的使用1．工作范围：观察细菌及相近大小的微生物，真核微生物的细胞器。2、使用特点：一

3、定要用油；操作要求较高。三、油镜头的使用3、要领及注意事项：（1）所用装片、涂片上一定不能有水；（2）先用低、高倍镜观察并选好视野，并将待观察目标调至视野正中心；（3）注意保护镜头和片子，从侧面观察镜头进入油系；（4）油镜头观察时，用微调调焦距，始终按镜、片分离方向用微调调焦距；（5）调焦距速度一定要慢，避免焦躁,因为图象出现的焦距范围很小；（6）注意光线的强弱；（7）用擦镜纸蘸取溶剂（二甲苯）擦净镜头和装片。四、革兰氏染色1．工作范围：细菌学中最重要的鉴别染色法之一，也可用于其他微生物的鉴别中。一般的微生物形态观察不必用革兰氏染色。2、基本步骤：1）初染：结晶紫染色；2

4、）媒染：碘液媒染；3）脱色：乙醇脱色；4）复染：番红复染;四、革兰氏染色3、要领及注意事项：1）菌种的菌龄，要选择生长旺盛期的典型菌体；2）制片，按单染色的基本要求操作；3）乙醇脱色时间是本实验成功与否的关键，注意衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约20—30秒，立即用水冲净乙醇；4）观察时，以分散开的细菌颜色为准。5）对未知菌进行革兰氏染色时，应选择两株形态不同、染色结果不同的已知菌和未知菌一起混合制片、染色。五．细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌体形态的差别（1）细菌、放线菌是原核生物，酵母菌和霉菌是真核生物，大小不同；（2）放线菌和霉菌是丝状菌，细菌和酵母菌

5、是非丝状菌；（3）霉菌有孢子柄、子实体等特化形态，放线菌没有。（4）一定要注意提问，不要理解为菌落形态。六、用血球计数板计数微生物的数量1．工作范围：此法计得的是死、活菌的总数，故称总菌计数法。2、基本步骤：1）稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液不浓，可不必稀释。2）镜检计数室：在计数前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则进行清洗。3）加样品：盖上盖玻片，用毛细管将菌液由盖玻片边缘滴一小滴，让其自行渗进计数室。不可有气泡。4）显微镜计数：五分钟后，先低倍镜找计数室，后高倍镜计数。一般以每小格5—10个菌体为宜。常选四角和中央五个中格计数。格线上菌体只数上线和左边线

6、。芽大于母体一半方计。同法计另一室。5）清洗血球计数板：自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，自行晾干。镜检，洗净为止。六、用血球计数板计数微生物的数量3、要领及注意事项：（1）计数结果是微生物总数，含死、活菌；（2）菌悬液要摇匀；（3）计数格数和分布要合理；（4）对压线、出芽等情况处理；（5）菌悬液稀释要适当，不要过浓或过稀；（6）光线要适中（尤其不要太强），否则找不到计数室；（7）要先低倍镜，后高倍镜。七、微生物大小的测定1．工作范围：原核微生物的测定一般要用油镜头；真核微生物的测定一般用高倍镜即可；测微尺多用来测定细菌和酵母菌，放线菌和霉菌较少。2、操作步骤1）目镜测微尺的标

7、定(1)放置目镜测微尺：测微尺刻度朝下；(2)放置镜台测微尺：测微尺刻度朝上；(3)校正目镜测微尺：按低、高、油顺序，使两种测微尺某一区间的两对刻度线完全重合，按下式计算：两对重合线间镜台测微尺格数×10目镜测微尺每小格长度（um）=———————————————两对重合线间目镜测微尺格数2）菌体大小的测定：换上装片，测出菌体长宽格数，算出菌体大小。3）取出目镜测微尺，将两种测微尺用擦镜纸擦净，入盒。七、微生物大小的测定3、要领及注意事项：（1）镜台测微尺刻度务必朝上；（2）目镜测微尺刻度朝下，放于目镜与镜头之间；（3）按低、