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1、分子实验基本操作培训余涛，郑勤思2008-4-13Outline分子实验基本流程介绍分子实验基本操作的原理、步骤及注意事项总结分子实验基本流程介绍感受态的制备PCR克隆目的片断酶切及酶切片断回收（电泳）连接小提质粒并酶切鉴定（电泳）大肠杆菌的培养转化分子实验基本流程介绍感受态的制备PCR克隆目的片断酶切及酶切片断回收（电泳）转化连接小提质粒并酶切鉴定（电泳）大肠杆菌的培养分子实验基本操作——大肠杆菌的培养原理大肠杆菌在37℃下在较好较快的进行增殖，4℃下则可较好停止代谢，便于保存。（长期保存应在-80℃用
2、15-20%甘油冻存）由于转入的质粒带有抗性标记，用带有抗生素的培养基即可进行选择性培养。分为固体培养基培养和液体培养基培养分子实验基本操作——大肠杆菌的培养Step0:LB培养基的配制(1L培养基含)10gTryptone5gYeastExtract10gNaCl15gAgar(仅在固体培养基中加入，注意琼脂为Agar琼脂糖/Agarose区分)1L去离子水一般一瓶配100-300mLStep0’:灭菌（此后一切保持无菌操作）分子实验基本操作——大肠杆菌的培养固体培养基培养（用于筛选或短期保存菌种）St
3、ep1:倒板微波炉加热培养基->室温冷却至60℃左右->移入超净台，加入抗生素（1000*的，即需稀释1000倍），摇匀->趁热快速倒入平板，12mL/板->超净台内室温冷却凝固Step2:接种划线法：烧红接种环->冷却->蘸上菌液->在平板上划线->灼烧接种环。多用于菌种保存平铺法：用玻璃刮刀将菌液铺干与平板上，多用于转化分子实验基本操作——大肠杆菌的培养固体培养基培养Step3：37℃培养箱中培养。注意需要先正置10min（防菌液倒流）再倒置培养（防止染杂菌）。注意培养时间不可过长，一般不超过16小时
4、，防止突变株产生。Step4：培养结束后，需放入4℃冰箱的，为防止染杂菌，最好用parafilm封口。分子实验基本操作——大肠杆菌的培养液体培养基培养（用于扩增）Step1：取出适量培养液于锥形瓶或试管。Step2:加入适量抗生素。Step3：将目标菌落挑入培养液。（可用接种环或枪头）Step4:将培养液放入37℃摇床中培养，转速一般为220rpm。（为什么要摇？）分子实验基本操作——大肠杆菌的培养注意事项：无菌操作！！！抗生素加入的时机及量培养时间（不可过长）返回分子实验基本操作——感受态的制备原理：感
5、受态-可接受外来DNA的状态CaCl2法制备–Ca2+可以使膜骨架发生改变，产生膜上的小孔洞，并可使DNA分子结合并进入细胞内。步骤：比较麻烦，属较考验分子操作的实验之一。往往大批量制备，因此不需经常进行。注意事项：感受态制备后应立即冻存于-80℃。使用时不可反复冻融。返回分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收原理：限制性内切酶：1）发现于细菌中，用于降解噬菌体的DNA；宿主自身的DNA则被甲基化。2）分为I、II、III类。常用II类（识别位点与酶切位点一致）3）区别与外切酶活性（内切酶彻底切断DNA双
6、链，外切酶只切其中一链，往往用于DNA复制的实时检验。）分类：单切和双切分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收单切：Step1:酶切体系的选定确定选用的酶->查找对应高效率的buffer（常用的buffer有H,M,L,K,T五种），确定要不要加BSAH,M,L,K,Tbuffer都有什么？H-High,M-Medium,L-Low,K-KCl,T-Tri-AcetateB-L,G-M,O-H,R-K,Tango-T分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收Step2:配制酶切体系：以10uL体系为例0.5u
7、L内切酶（含50%甘油防冻）1uLBuffer(10*)5uL质粒3.5uL去离子水原则：1）甘油含量不可超过总体系5%，防止星火性2）质粒可根据具体情况调整3）内切酶切记不可置于常温！！分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收Step3:置于37℃培养箱中，温育2-4h。（用水浴也可以，但可能会使溶液因蒸发而产生浓度不均匀）。注意有些特殊的酶所需的条件有所不同，主要是温度条件。Step4:纯化，方法同PCR片段纯化。Step5:电泳检测分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收双切：Step1:酶切体系的选定
8、确定选用的两种酶->查找对应双切的Buffer，同时看与分别单切的高效buffer是否吻合->确定要不要加BSAStep2:配制酶切体系。与单切类似，但需要注意酶的用量。（甘油含量不可超5%.）Step3:37℃温育2-4hStep4:凝胶回收分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收凝胶回收：即双切后将所需要的小片段重新富集纯化。Step1:电泳，电泳过程中称重一小离心管。Step2:电泳结束后，将凝胶置于成像仪内。Step3:
