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1、LC-MS/MS样品分析一般步骤SEP162002准备工作1.核对样品,名称,编号. 2.通过询问送样人,查阅文献等,了解样品其他知识,例如熔点,沸点,溶解性等理化性质,样品来源,光谱,波谱数据等,LC条件,可能的杂质,样品含量,色谱柱类型,规格,流动相,流速等等.原来溶剂,若不合适,N2吹干,再用甲醇或乙睛定量溶解.保存状况,对温度,光敏感否,送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求. 3.浓度非常低的样品不能保存太长时间,容器吸附、分解等原因使样品浓度降低,标准品工作液现配现做.先定性后定量首先,察看存在哪些离子,通过改变DP,观察离子的增减,M+1,18,2
2、3等等,初步判断分子量,再进行PRODUCTSCAN,找出碎片信息,从中选定MRM需要测定的一对或更多离子对,为最后LC-MS/MS联用做准备.特征离子的质量色谱在复杂混合物分析及痕量分析时是LC／MS测定中最有用的谱图，当样品浓度很低时LC的TIC上往往看不到峰,此时,根据上一步得到的分子量信息,输入M+1或M+23等数值,观察提取离子的质量色谱图,检验直接进样得到的信息是否在LC-MS上都能反映出来,确定LC条件是否合适,然后进行MRM测定.正离子方式常出现如下离子:-Na22Da.higherthanM+H-K38Da.higherthanM+H-Li9Da.highertha
3、nM+H-NH417Da.higherthanM+H-ACN40Da.higherthanM+H2M+H,2M+Na等负离子方式常出现如下离子:-TFA114Da.higherthenM-H(113and227background)-Acetate60Da.higherthenM-H-Formic46Da.higherthenM-H-Cl36Da.higherthanM-H根据样品性质确定离子化方式:高极性化合物,大分子,蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；胺类、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等,适合ESI(IS)。弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化合
4、物如氨基甲酸酯、脲等，适合APCI（HN）。ESI不行的：极端非极性化合物如苯等;APCI不行的：非挥发性样品;热稳定性差的样品。碱性化合物宜用正离子方式，酸性化合物宜用负离子方式，如未知,可能正负都要做,有些化合物正负都出峰,选择灵敏度高的方式,不明确的优先用正离子方式试。影响分子量测定的因素1）PH的影响-正离子方式PH要低些,负离子方式PH要高些,除对离子化有影响外,还影响LC的峰形,以至定量误差。2）气流和温度,当水含量高及流量大时要相应增加.3）溶剂和缓冲液流量,流速适当高可以提高出峰灵敏度.4）溶剂和缓冲液的类型,正离子甲醇好,负离子乙腈好些,不挥发性盐的影响-大量累积使
5、仪器灵敏度下降. 5）根据样品结构和性质,选择合适的液相色谱类型. 6）合适的电压-样品在源内分解或碎裂,温度,DP电压要适当. 7)杂质的影响,溶剂的纯度,水-纯净水,当成分复杂，杂质太多时,竞争使被测物离子化不好,同时使LC分离不好.8）样品浓度不够-浓缩.样品的预处理常用方法有:a）超滤b）溶剂萃取／去盐c）固相萃取d）灌注（Perfusion）净化／去盐e）色谱分离反相色谱分离亲和技术分离母离子选M+H,或M-H最好,但有时只有M+NH4,M+Na等,这样CAD能量可能需要高些,子离子当然选相对丰度高的,可以不只一个,通过优化仪器参数,使得母子离子都达到一定强度平衡,使MRM
6、灵敏度最高.色谱柱的选择原则:定性可长些,定量尽量短,提高效率,细径柱如2mm的,1mm的,IS可不分流,如4.6mm柱用1ml流量时灵敏度 还不是最佳,不如流量低时更好.优化仪器,先用注射泵优化COMPOUND项下面的参数,如DP,CE及CAD等,再接通LC用FIA优化其他参数及源位置,或接一个三通,样品仍由注射泵进入离子源,同时LC保持需要的流量.内标物与被测物的化学性质有区别时,要注意干扰基质对他们的离子化影响的不同，尽量选同系物。色谱柱和管路的清洗新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净,某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中,进样顺序要先稀后浓.调机时,注意标尺不要偏差太大,先
7、用标准品校准仪器,如偏差很小,可不用重新校准仪器,做PRODUCTSCAN时,注意小数点后的位数,MRM输入要准,灵敏度才高.LC梯度的设定,目的是快速分离,峰形好,缩短时间,提高效率,选短柱亦是如此.溶解被测物最好用流动相,或纯甲醇,乙睛,如果溶剂含水比流动相多,则峰形不好,变宽,定量不准.优化质谱仪器,调整LC参数,选择进样方法等所有的工作 都是为了使仪器灵敏度最高,选择性最好,使得被分析物能够被准确无误的测定.
