3酶、细胞、原生质体固定化

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1、第二章酶与细胞的固定化固定化生物技术——通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。3.分离纯化困难。游离酶的缺点：一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点1.固定化酶(immobilizedenzyme)固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。第一节酶与细胞的固定化什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术优点：(1)可提高稳定性。(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。缺点：(1)存在扩散限制

2、。适于催化小分子物质。(2)酶活性下降。2.固定化细胞（immobilizedcell）固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。优越性：(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作;(2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系完成部分代谢过程。局限性：(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物。(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。3.固定化原生质体意义：(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高。二、固

3、定化方法固定化方法（一）酶的固定化方法吸附法共价偶联法交联法包埋法网格型微囊型离子交换吸附物理吸附法依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。1.吸附法（adsorption）根据吸附剂的特点分:1）物理吸附法（physicaladsortion）作用力：氢键、疏水键常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。2）离子结合法（ionbinding）作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。缺点：结合力弱，易解吸附。借助

4、共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。2.共价偶联法（covalentbindingorcovalentcoupling）1）载体：亲水载体优于疏水载体如:天然高分子衍生物:纤维素葡聚糖凝胶亲和性好，机械性能差琼脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺聚苯乙烯机械性能好，但有疏水结构尼龙2）偶联方法：偶联成功与否取决于：载体：功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。常用的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。缺点：反应条件较激烈，易影响酶的

5、空间构象而影响酶的催化活性。3.交联法（crosslinking）借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。双功能试剂：常用的是戊二醛OOH—C—CH2—CH2—CH2—C—H戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：交联法不使用载体。交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。缺点：(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。4.包埋法

6、（entrapment）将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为：网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。1）网格型包埋法（gel(lattic)entrapment）又称凝胶包埋法凝胶包埋条件酶活性强度天然凝胶琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶温和不变差合成凝胶聚丙烯酰胺、光交联树脂聚合反应部分失活高使用的多孔载体及其特点海藻酸钙凝胶包埋法：滴至海藻酸钠溶液＋E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)角叉菜胶包埋法：滴至角叉菜胶＋E(orcell)KCl溶液中IE(orIC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：APAcr+B

7、is+E(orcell)IE(orIC)TEMED2）微囊型包埋法（microencapsulation）又称半透膜包埋法将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”。与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。包埋法是目前应用最多的一

8、种较理想的方法，与其它固定化方法相比：优点：不与酶蛋