基因芯片技术

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1、基因芯片技术朱丽雅０６／１１／１３生物芯片(Biochip)技术通过加工工艺同时将大量的探针分子固定到固相支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息并进行高效的解读和分析．１.基因芯片２.蛋白质芯片３.芯片实验室命名：“GeneChip”——Affymetrix率先专利注册Microarray，DNA微阵列——通用地位80年代——克隆，90年代——PCR；21世纪——芯片Microarray——近10年来生命科学研究领域中的最高效技术之一优

2、点传统：Northern杂交、RT-PCR和核酶保护性分析等——只针对单个基因来分析Microarray：高通量模式研究效率——提高成千上万倍研究层面——总体全局的基因之间相互关系广泛应用——基础研究方面如基因表达水平的检测、基因间相互作用模式、基因诊断、测序；产业化方面也有药物筛选、药物基因组图谱、个性化治疗、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督等许多领域。基本工作流程以AffymetrixGeneChip为例．样品制备标记杂交数据获取和分析样品制备样品DNA样品RNA样品——先

3、逆转录成cDNA样品核酸的拷贝数提高达到检测的灵敏度样品或后续测试信号适当的放大样品扩增同时对样品核酸分子大量的区域进行扩增e.g.PCR去除了多余的RNA（rRNA占约80%）,RNA污染增加非特异性扩增标记方法标记引物标记三磷酸脱氧核糖核苷酸标记物：荧光分子直接标记生物素间标——放大信号荧光标记:单色标记——以减少流程或者芯片制作过程中所造成的控制性差异，确保实验的可靠性和可重复性。双色标记——用不同颜色荧光素标记两个引物杂交反应（关键）通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减少

4、生物分子之间的错配比率，从而获取最能反映生物本质的信号。dsDNA芯片单链DNA（寡核苷酸）芯片——有助于防止双链DNA在杂交时产生干扰，而且芯片上各点寡核苷酸长度相对一致，使得杂交条件较为一致，有助于减少由于双链DNA长度差别导致杂交条件差异的问题。按载体上所点探针的长度分为：(1)cDNA芯片:由Schena建立,将特定的cDNA经PCR扩增后借助机械手直接点到基片上。(2)寡核苷酸芯片:由Fodor首先报道,用照相平板印刷术和固相合成技术在基片上生成寡核苷酸,分为长寡核苷酸芯片和短寡核苷酸芯片

5、,与cDNA芯片制作的一个主要不同点是多一步转录获得cRNA的过程。起初,人们认为长寡核苷酸芯片和cDNA芯片有更高的特异性和灵敏度。但短寡核苷酸芯片同样有效和特异。信号检测芯片上点的高集成度要求高灵敏度的检测设备。双色标记为例：１.芯片扫描仪采集各反应点的荧光强弱和荧光位置２.对每一种染料扫描　一定的软件处理并合并得到每个点的重叠图３.点数和每点的强度定量确定，确定背景强度并被减掉４.对照点，或是额外加入的序列，或是报道基因，或是每个样本的总的荧光信号强度，来帮助校正两种荧光染料的标记差异和检测效

6、率５.两个样本中的每个基因信号用控制好的强度进行扫描测量６.经相关软件分析图像，即可以获得有关生物信息。芯片的扫描灰度图(对照)（处理）数据分析（复杂）一位科学院院士说，“以后生物实验室中要有50%-70%的人从事生物信息学工作”呢。而且据统计，国际生物芯片的专利62%都集中在数据分析领域，可见这一方面确实是芯片研究领域的重点和焦点。很多芯片产品的供应商都有提供服务项目。靠自己数据的描述目的：是通过图形对数据的分布情况进行初步的判断。散点图是一种常用的方法.远离对角线的基因为表达差异明显的基因。聚类

7、分析计算样本（这里指芯片上各个点扫描得到的数据）间的距离，以判断性质是否相近．聚类方法的局限:１.要聚类结果要明确就需分离度很好的数据２.由线性相关产生。但生物系统却具有多因素和非线性的特点点,往往进行简单的分类是无效的。层次式聚类：计算各数据点间的距离后把相近距离的聚为一组,再计算各组间的距离使之合并成更大的组,不断重复这一过程直到最后聚成一组以树状结构重新安排的数据.其结果直观而且能以树状结构分支的长短来评价基因的相似性.培养的成纤维细胞加入特定刺激物后，用基因芯片的方法研究其表达谱的变化。Ti

8、me表示十二个时间组（最左边一列未加刺激物），纵向排列的小方格表示基因。绿色表示下调87.5%，红色表示上调8倍。经过聚类分析后，相关的基因被聚集到各自的簇中。A类基因是与胆固醇合成相关的基因，B类是细胞周期相关基因，C类是立即早期反应基因，D类是与信号传导和血管生成相关的基因，E类是创伤修复、组织重塑相关基因。软件和网址树状图：美国斯坦福大学的Cluster软件（下载网址http://rana.lbl.gov），免费软件。这是MichaelB.Eisen博士写的一个