基因芯片技术概要

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1、一：基因组DNA的提取采用SDS法，具体步骤如下：①称取2-4克（油菜）叶片，放入研钵中，加液氮后充分研磨。②转入20ml(约样品的一倍体积)DNA提取液中，混匀，65℃水浴振荡（301-501rpm）1h左右。③取出冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）混合液，充分混匀后，置摇床上轻摇一小时。④室温振荡1h左右使之完全混合。⑤室温3000rpm离心30min。⑥取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃静置1h后，使DNA沉淀。⑦钩出DNA，于70%酒精中漂洗2-3次。⑧挑出DNA，用DNA真空干燥机真空干燥后，溶于适

2、量TE（pH=8.0）中。DNA纯化：加入适量10mg/mlRNase，置37oC30min，充分降解RNA。再用氯仿-异戊醇抽提一次，DNA沉淀、干燥、溶解程序同上。取适量DNA稀释液与标准浓度λDNA同时在1%琼脂糖凝胶电泳上进行DNA定量并检查DNA质量。附：（1）DNA提取液（1000ml）1MTris-HCl（PH8.0）100ml0.5MEDTANa2（PH8.0）100ml5MNaCl100ml20%SDS62mlNaBisufite(CodaS-9000)sigma)3.8gddH2O637.5ml即配即用，充分混

3、匀后调节pH至8.0。（2）50×TE（100ml）Tris-HCl242g冰醋酸57.1mlEDTANa218.6g加水至1000ml，灭菌。（3）Tris-HClpH=8.01M1000mlTris碱14.1gH2O800ml浓HCl49ml混匀充分溶解后，调整pH至8.0，灭菌。PCR反应在10ml体系中进行模板（基因组DNA）1ml（10ng/ml）Primer(R)0.2ml（10uM）Primer(F)0.2ml（10uM）10×buffer1mldNTP(2.5mM)0.8mlMgCl2(25mM)0.8mlTaq酶

4、0.1ml(0.5U)ddH2OH2O5.9ml10mlPCR扩增产物中加入琼脂糖凝胶电泳专用的加样缓冲液2ml，混匀，取4mlPCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。电泳时总电压为120V，电泳1h左右，UV检测扩增产物的多态性。PCR扩增条件94℃3min94℃35cycles30SecX（按所用引物确定退火温度）50Sec72℃1min72℃10min4℃保存二：种子贮藏蛋白质样品的提取按Hurkman和Tanaka（1986）的苯酚为基准的总蛋白样品提取方法，并有所改进。将0.5g成熟种子在液氮中研磨成粉末状，分别加入

5、提取液10mL[50%（v/v）苯酚,0.45M蔗糖,5mMEDTANa2,0.2%（v/v）β-巯基乙醇,50mMTris-HCl，pH8.8]，充分混匀后将装有匀浆液的离心管在4℃条件下，摇床上振荡30min，然后4℃5000g离心15min，吸取上清液至新一离心管中加入5倍体积的-20℃的0.1M乙酸铵（0.7708g乙酸铵溶解在无水的100mL甲醇中），-20℃冰箱静置沉淀16h或过夜。第二天4℃5000g离心10min，沉淀的蛋白用0.1M乙酸铵洗涤2次，再用冰冻的80%的丙酮洗1次，最后用70%的乙醇洗涤后，蛋白粉37

6、℃干燥后，放置-70℃冰箱保存备用。（接下来要做SDS-PAGE跑垂直胶）SDS-PAGE电泳按Sambrook等（1989）的SDS-PAGE程序，取适量种子总蛋白样品与2×样品缓冲液（100mmol/LTris-HCl，pH6.8，200mmol/LDTT，4%SDS，20%Glycerol，0.2%bromophenolblueR)混合，99℃变性处理10min后，在8%的分离胶和5%的浓缩胶组成的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。使用DYY212型电泳仪和DYCZ228C型垂直双板夹芯式电泳槽，电极缓冲液为十二烷基硫酸钠-甘氨酸(

7、pH8.3)。每个样品点样15µl，室温下40V电压待指示剂到达分离胶与浓缩胶界面时，再调至100V稳压电泳，待指示剂迁移至凝胶底部后结束电泳。染色和脱色取下胶后，在染色液（1.0g考马斯亮蓝R250，450mL甲醇，100mL冰醋酸，450mL双蒸水）中染色30min，然后用脱色液（100mL甲醇，100mL冰醋酸，800mL双蒸水）脱色1d。Rf值及统计蛋白质亚基条带数参照刘敏轩等（2006）的方法，根据电泳结果计算每个实验材料蛋白带的Rf值及统计蛋白质亚基条带数。蛋白质的相对迁移率Rf=蛋白带迁移距离/溴酚蓝迁移距离。记录样

8、品中产生的多态性蛋白带，同一Rf值位置上有蛋白条带的记为1，无蛋白带记为0。输入计算机，用cluster软件统计分析，根据Main方法构建表征树。三：叶片全蛋白的提取——三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法取油菜叶片3-4g放入预冷的研钵中加入液氮研磨成