生化药物分析及生物检定技术

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1、定义：指运用生物化学的理论、方法和技术，从动、植物等生物体中提取分离的天然活性物质，以及这些物质及其衍生物的化学合化、半合成和现代生物技术制得的产品。生化药物分析常测定：氨基酸及其衍生物、药用活性多肽、药用蛋白、药用酶、辅酶、核酸及其降解产物和衍生物、多糖和脂类药物、基因工程DNA重组药物等。优点：易被机体吸收，针对性强，疗效可靠，毒副作用小，营养价值高等。一、生化药物分析的特点1、分子量不确定性(1)只有氨基酸、核苷酸、辅酶、甾体激素等化学结构明确的小分子化合物，分子量确定。(2)大多分子量不确定，结构不确定因此，生化药物常需进行纯度及分子量测定。2、分析项目的特殊性

2、(1)除采用理化法分析外,尚需用生物检定法进行检定,以证实其生物活性(2)因易引入杂质，常需做热源、热敏、异常毒性、安全性试验(3)多用含量测定表示主药含量，但酶类需进行效价/酶活力测定，来表示有效成分含量。3、分析方法的多样性如：理化、生化、生物检定法等。二、生化药物分析的方法1、鉴别(1)化学反应法(2)UV(3)酶法：如尿激酶-蛋白水解酶(4)电泳法：如肝素-糖凝胶电泳法(5)生物法：利用生物体进行试验2、杂质检查(1)一般杂质(2)特殊杂质3、安全性检查(1)热原检查：由微生物所分泌的某一种代谢产物，一般以为是内毒素，能使恒温动物体温升高。方法：家兔法/鲎试剂(

3、2)异常毒性试验用一定剂量药物按指定的操作方法和给药途径给规定体重的试验动物，观察其急毒反应(是否死亡)，是一个限度试验。异常毒性试验出现：主要取决于供试品在生产中是否引入，可发生异常毒性杂质。(3)过敏试验检异性蛋白试验----引起多种过敏反应轻:皮肤产生红斑/丘疹过敏重:窒息、发绀、血管神经性水肿血压降低、休克、死亡。(4)降压物质检查指药物中含有能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或其他物质。来源：用动物脏器/组织制备时，在正常组织中存在。方法：猫/狗血压法检药物中所含降压物质。(5)无菌检查对药物及敷料是否染有活菌的检查。由于许多生化药物不能高温灭菌，故检查此

4、项。4、含量/效价测定表示方法：(1)含量百分比：适用于化学结构明确小分子/经水解后变成小分子药物。(2)生物效价/酶活力单位表示，适于酶类、蛋白质类。常用方法：(1)酶法(2)电泳法(3)生物检定法(4)理化法(1)酶法①酶活力测定法：a.终点法：单酶反应定量法指示酶反应偶联定量法b.取样测定法c.连续测定法②酶分析法：a.动力学分析法b.总变量分析法(2)电泳法①自由界面电泳法②高效毛细管电泳法③区带电泳法a.纸电泳法b.醋酸纤维素薄膜电泳法c.聚丙烯酰胺凝胶电泳法d.十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳法(3)生物检定法是利用药物对生物体的作用以测定其效价或

5、生物活性的一种方法。以药物的药理作用为基础，生物统计为工具，运用特定的实验设计，通过供试品和相应的标准品或对照品在一定条件下比较产生特定生物反应的剂量比例，来测得供试品的效价。(4)理化法①重量法a.提取法b.挥发法c.沉淀法②测定法③比色法④UV⑤高效凝胶过滤色谱法a.分离根据有效粒径b.分离在固定比例水液中c.活性蛋白可回收⑥高效离子交换色谱法a.分离根据离子化浓度b.分离盐浓度增大的梯度洗脱法c.分离在阳/阴离子交换间呈现差异大d.柱效中等并具高质量的活性回收三、生化药物分析进展总体向理化/仪器分析发展如：GC、HPLC、UV、TR、质谱、磁共振、超离技术、放射免

6、疫、酶试剂、酶电极检测等。另，应用细胞培养，对生化药的活力和效价检测。单克隆体免疫分析技术及基因分析技术，提高检测限量和灵敏度。生物检定技术第一节微生物限度检查一、定义微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。二、检查方法药品微生物限度检查采用活菌计数，计数方法包括：平皿法、薄膜过滤法。一、平皿法1．设备、仪器及用具无菌室、超净工作台、恒温培养箱(室)、匀浆仪、恒

7、温水浴箱、电热干燥箱、冰箱、高压蒸汽灭菌器、菌落计数器(JLQ-ST或JLQ-S2型)、显微镜(1500×)、天平(感量0.1g)、锥形瓶、研钵(直径10～12mm)、培养皿(直径90mm)、量筒、试管及塞子、吸量管(1mL、10mL)、载玻片、盖玻片、玻璃或搪瓷消毒缸(带盖)、大橡皮乳头、小橡皮乳头、无菌衣、无菌裤、无菌帽、无菌口罩(也可用一次性物品替代)、接种环、酒精灯(乙醇灯)、乙醇棉球、灭菌剪刀及镊子、灭菌称样纸及不锈钢药勺、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆等。玻璃器皿均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽灭菌12l℃20min，