RT-PCR中引物的选择指南

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1、RT-PCR中引物的选择指南一.用于RT-PCR的引物1.特异性引物（跨内含子设计引物）2.随机引物（Randomprimer）3.oligo(dT)引物二.反转录酶M-MULV和AMV三.常用内参引物的参考序列一．用于RT-PCR的引物一般做RT-PCR进行第一链cDNA合成的起始可以使用特异性引物、随机引物（Randomprimer）、oligo(dT)三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量、种类及效果（如表一）。1.特异性引物（跨内含子设计引物）对于RT-PCR，引物设计质量影响RT的结果，而且不同引物退火温度本来就不相同，

2、所以第一链cDNA合成不推荐使用。但是如果以RNA为模板进行一步法检测基因表达情况，一般建议添加特异性引物，这样设计的主要目的是消除RT-PCR时基因组DNA污染对结果的影响。跨内含子设计引物有两种做法（如下图A和B）：1.1在两个不同的外显子上设计引物，上下引物分别位于不同的外显子上这样从和cDNA和基因组DNA中扩增的片段大小不同(基因组DNA中的包含内含子扩增的要大些)，从而可以通过用合适的延伸时间来限制基因组中大片段的扩增，消除基因组DNA污染的影响(这要求跨越的内含子要大些)。1.2上游或者下游引物或者两者，引物本身在两个不同的外显子上注意引

3、物在两个外显子上分布，在“内侧”要少些，少于8bp左右。这样的引物就不能从基因组DNA扩增，从而消除基因组DNA污染的影响(这要求目的基因具有较多的外显子，从而有较多的选择，引物本身质量可能不好。2.随机引物（Randomprimer）在两步法RT-PCR中，mRNA必须先转录为cDNA。在这种情况下，采用不依赖序列的引物，例如随机引物和oligo(dT)引物。随机引物，一般指的是多个任意的碱基连接而成的一套寡聚引物组，常见的是random（6），random6（9），random（10），如果6个碱基的随机序列，则是5’-d（NNNNNN）-3’，共

4、有4条引物。原核生物由于没有poly(A)，因此在进行总mRNA的RT时要用到随机引物，由于其比较短小，且随机组合丰富，所以在mRNA上的结合也很多，产生短的，部分长度的cDNA，因此也可以进行有效的RT。这种方法经常用于获取5’末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。因此一般适用于长的或具有发卡结构的RNA；适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有单一模板RNA的反转录反应。在RT-PCR用随机引物制备CDNA时，要去除总RNA中的tRNA、rRNA，只保留mRNA。因为体系中所有RNA分子全部充当了cD

5、NA第一链模板，所以随机引物法是三种方法中特异性最低的，通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。所以随机引物介导制备的cDNA产物复杂程度高，从而降低了后续PCR反应的敏感度和特异性。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。2.1随机引物优先应用范围：üRT-PCR实验中，合成带有或不带有poly（A）的cDNA。ü长片断的mRNA5’—区域的RT–PCR。ü模板RNA具有较多二级结构的CDNA的合成。ü可用于Northern/Southern杂交、

6、原位杂交和克隆／噬菌斑杂交的标记探针。mRNA差异显示。ü病毒鉴定，因为大多数病毒的序列是未知的，所以在RNA病毒的研究中一般用随机引物进行扩增并进行鉴定。3.oligo(dT)引物：Oligo(dT)一般指的是多个T碱基连接而成的寡聚引物，主要是针对真核生物具有Poly(A)尾时设计的用于RT，因此RT-PCROligo(dT)起始比随机引物特异性高。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，因此之前必须先把poly(A)+RNA提取出来。所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不

7、需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μgoligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。3.1oligo(dT)适应范围：Oligo(dT)针对真核生物具有Poly(A)尾设计，所以特异性好，但是同时对RNA样品要求较高，是生成全长cDNA的大多数两步RT-PCR应用中较受欢迎的引物延伸法。原因是许多逆转录酶不能高效地将全长mRNA序列转录到5’端。但是即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。因此对于较长的mRNA，或是因为RNA中间可能具有的二级结构等往往使得反转录反

8、应提前终止，也导致不能达到mRNA的5’末端，就是扩增片段的长度有限，这一方面和RNA完整性和