犬孕激素酶联免疫分析(progestogen)

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1、犬孕激素酶联免疫分析（progestogen）ELISA试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究研究使用产品编号：E0697c预期应用ELISA法定量测定犬血清、血浆、或其它相关液体中孕激素含量。概述孕激素主要由黄体产生，故又叫黄体酮。孕激素通常要在孕激素作用的基础上才能发挥其作用。孕激素的主要作用，是促进子宫内膜特别是腺体的增长，为接纳受精卵做好准备，如受精卵着床后，使胚胎继续发育。对子宫内膜癌及增生过度的内膜腺体，孕激素则能使之萎缩退化。此外还能抑制子宫收缩，并减弱子宫对催产素的敏感性，使子宫活动减少，而起保胎作用。同时还与孕激素一起使乳腺发育，为产乳作好准备。实验

2、原理本试剂盒应用竞争抑制酶标免疫分析法测定标本中孕激素水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，固相抗体与一定量的生物素标记的孕激素和非标记抗原(标本或标准品)进行竞争抑制反应，待测定的标本量越多，抗体与生物素标记的孕激素结合就越少，反之结合就多。最后再加入HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的孕激素呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。试剂盒组成1．酶联板：一块（96孔）2．标准品：0.5ml/瓶×6瓶。其浓度依次为100

3、ng/mL，20ng/mL，5ng/mL，1ng/mL和0.2ng/mL，0ng/mL。3．检测溶液A：1×6ml4．检测溶液B：1×6ml5．底物溶液A：1×7ml6．底物溶液B：1×7ml7．浓洗涤液：1×15ml，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。8．终止液：1×7ml标本的采集及保存1．血清：采集病人空腹血，标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。2．血浆：采集病人空腹血，可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20

4、℃保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。操作步骤各试剂在使用前平衡至室温。1．加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品50ul。1．每孔加入检测溶液A50ul及检测溶液B50ul，轻轻混匀，37℃，60分钟。2．洗板3-5次，350ul/每孔，甩干。4．依序每孔加底物溶液A、B各50ul，37℃避光显色15分钟。5．依序每孔加终止溶液50ul，终止反应。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。注：1．每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底

5、物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。特异性本试剂盒可同时检测重组或天然的犬T3，且与其它相关蛋白无交叉反应。检测范围：0.015ng/mL-120ng/mL计算以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐

6、标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。注意事项1．洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。2．一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。3．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。4．如标本中T3含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。5．底物请避光保存。6．温育反应过程中请帖粘胶板7．样品应尽早检测，贮存时间长，内含被检测物的活性将损失。说明1．试剂

7、盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。2．有效期：6个月3．浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。4．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。