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1、MDA法全基因组扩增(注:为避免DNA污染,需在超净工作台中操作,操作前紫外杀菌30min｡使用无菌耗材,且使用带滤芯的吸头)1、准备BufferDLB:将BufferDLB管离心使干粉聚集到管底,加500μl无核酸酶水,Vortex彻底混匀使其溶解,短暂离心｡(溶解后BufferDLB可在-20°C保存6个月)2、准备BufferD2:(下表为配制12个反应,-20°C可保存3个月)ComponentVolume1MDTT3μlBufferDLB33μlTotal36μl3、将细胞样本离心,使其离心至管底,用PBS补至4μl｡4、加3μlBuffe
2、rD2,手指轻轻拨动PCR管混匀,瞬时离心｡(注:加反应液时枪头不要碰到细胞样本以免带走细胞｡细胞样本液一般为1-2μl｡)5、PCR仪上65°C孵育10min,【程序设MDA1】加热盖(热盖温度可设为90°C)｡取出时放冰上.6、反应完成后立马加3μlStopSolution,手指轻轻拨动PCR管混匀,瞬时离心,放冰上｡7、冰上融化REPLI-gscDNAPolymerase(最后加入),其余组分室温融化后vortex混匀,瞬时离心后放置冰上｡按照下表配制反应:ComponentVolumeH20sc9μlREPLI-gscReactionBuff
3、er29μlREPLI-gscDNAPolymerase2μlTotal40μl(注:ReactionBuffer解冻后可能会有沉淀,Vortex约10s使其彻底溶解后用)8、上述反应液混匀后取40μl加入步骤6的10μlDNA中,混匀,瞬时离心｡9、PCR仪上30°C孵育8h｡(热盖温度为70°C)10、PCR仪上65°C孵育3min使酶失活｡【程序设MDA2】11、扩增产物4°C短期保存,若长期保存则置于-20°C。PGS精细化操作流程MDA产物纯化(Wizard@SVGelandPCRClean-UpSystem)1、加50μlMembrane
4、BindingSolution于50μlMDA产物中,vortex后轻甩室温放1min,12000rpm1min｡2、加700μlMembraneWashSolution,12000rpm1min，弃液倒扣，注意不要交叉污染样本。3、加500μlWashSolution,12000rpm1min｡4、12000rpm空转2min弃净多余液体,室温晾干3min｡5、加50μl无核酸酶水至离心柱膜上,将离心柱换到新的EP管上，室温放置5min后12000rpm离心1min,收集产物DNA｡纯化后的产物检测1、浓度:取2μl稀释至20μl,再取2μl用Qu
5、bit方法测浓度。2μl样本：198μl工作液；标准品10μl：190μl工作液（工作液1μl染料:199μlbuffer/样本）标准品1#和2#均需要配置。静置3min后测浓度。2、5对引物检测PCR反应体系：名称体积2×PCRMasterMix12.5μlPrimerMix8μl模板无法定浓度到60-180ng/μl每个样本取0.5μl水4μl－模板Total25μl5对引物检测PCR反应条件：【】反应温度反应时间循环数95°C5min195°C30s4060°C30s72°C30s72°C10min14°C---Hold3、电泳:3%琼脂糖凝胶
6、电泳检测,上样量约为10μl样本+3μlloadingbuffer｡120V15min。(5条带为标准，3条带亦可上机测序)。PGS精细化操作流程文库构建(用lifeTech的IonXpressLibraryKit)一、DNA片段化:1、DNA起始量为120ng,取适量体积DNA于PCR管中,补水至35μl｡2、IonShearplus10XReactionBuffer和EnzymeMixIIVortex混匀各5s,瞬时离心后放置冰上｡3、加5μl10XReactionBuffer于PCR管中,吹吸10次左右混匀｡4、加入10μlEnzymeMixI
7、I,吹吸混匀,手指轻轻拨动混匀｡5、PCR仪上,37°C孵育35min｡【】(注意:严格控制反应时间)6、孵育后立即加入5ulStopBuffer,vortex彻底混匀,瞬时离心后置于冰上｡二、纯化1、取出XP磁珠充分混匀并平衡到室温，取1.5mlEP管加99μlXP磁珠/管，将样本加入其中，Vortex5s，室温孵育5min，离心2s。｡2、磁吸3—4min,弃上清。3、加500μl新鲜配制70%乙醇,磁力架上旋转2周约30s,弃上清｡4、重复步骤3｡室温晾干（观察，若转动EP管磁珠不再移动即已晾干）。5、加25μllowTE，Vortex5s，静
8、置30s,瞬离，磁吸3min，吸25μl上清至0.2mlPCR管中。三、连接头注意：一次只能打开一管barc
