紫外可见光分光光度计酶活性测定实验流程和方法

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1、文献参考使用酿酒酵母己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在EppendorfBioSpectrometer®kinetic紫外/可见光分光光度计上进行酶动力学测定简介该用户指南将演示使用EppendorfBioSpectrometer紫外/可见光分光光度计进行的酶活性测定。为优化测定流程，先使用单波长λ-连续（Singleλ-continuous）测定法进行初步测定。然后，根据这些结果进行实际活性测定。通过线性回归确定酶活性。为了进行测定，使用源自面包酵母的己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行偶联反应。

2、由于EppendorfBioSpectrometerkinetic紫外/可见光分光光度计（动力学款）带有温控比色皿槽，也可演示这一反应对温度的依赖性。在37°C时，检测到最高活性。引言己糖激酶反应的代谢意义糖酵解几乎所有生物新陈代谢的一个中间环节就是葡萄糖分别在细由于NADP（NAD）和NADPH2（NADH2）分别参与中间代胞的细胞液或细胞质内进行的酶促降解。这一过程叫做糖酵谢中几乎所有酶促反应，酶活性的确定主要是通过NADPH2解。葡萄糖通过分步反应转化为2分子的丙酮酸。1分子的的增加或减少来确

3、定。NADP和NADPH2均在260nm波葡萄糖生成2分子的ATP和2分子以NADPH2形式存在的长下显示出最大吸收峰。然而，NADPH2在340nm波长下氧化还原产物。然后，丙酮酸进入初步代谢途径，即丙酮酸还会显示一个波峰（图1），这就可以在光度测定上区分循环，进一步生成呼吸链的还原产物，最终转化为氧。最终NADPH2和NADP。的降解产物是H2O和CO2。NAD(P)/NAD(P)H2光谱己糖激酶反应活化葡萄糖3.000葡萄糖的降解维持着所有生物的呼吸作用。在降解葡萄糖之2.500NAD(P)前

4、，需使葡萄糖易于降解，即激活。这一过程包括己糖激酶2.000NAD(P)H2催化的葡萄糖磷酸化和消耗ATP，生成葡萄糖-6-磷酸。后度光1.500者实际上是糖酵解的初始底物（图1）。吸1.000另外，葡萄糖-6-磷酸也是进一步重要代谢途径，即戊糖0.500磷酸途径的初始底物。戊糖磷酸途径可提供重要的氧化还原0.000240260280300320340360380400产物，如NADPH2，以及被认为进一步参与分解代谢和生物波长[nm]合成途径的各种碳水化合物。图1：NADP/NADPH2的吸收光谱

5、代谢酶的酶促降解检测NADPH2在340nm波长下的吸收峰可以区分两种物质。这样，由于这些相关代谢途径和酶的意义重大，所以它们在生化研NADP/NADPH2依赖性酶的活性就可以通过在340nm处的吸光度究和教育领域中倍受关注。其中一个重要的方面是酶活性的值变化来确定。测定，因为酶活性是酶的独有特征。测定各个酶活性的基本方法是使用分光光度计进行光度测定法。1文献参考文献参考使用酿酒酵母己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶活性测定不但可以确定酶的性质，还可以用来分别检测某方法些底物或底物的浓度。如可以使用

6、以上提到的己糖激酶反应在EppendorfBioSpectrometer®kinetic紫外/可见光测定葡萄糖或ATP的浓度。通过与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶己糖激酶活性测定在偶联反应中生成NADPH2可间接检测葡萄糖或ATP。生所有测定均是在EppendorfBioSpectrometer紫外/可见光分光光度计上进行酶动力学测定成ATP的量与葡萄糖或ATP的量成正比（图2）。分光光度计上进行的。为进行酶测试，准备以下溶液：•10ml0.1MTris缓冲液pH7.02+己糖激酶/Mg•1ml0.1MMg

7、Cl2葡萄糖+ATP葡萄糖-6-磷酸+ATP简介•1ml5mM葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶葡萄糖-6-磷酸+NADP6-磷酸葡萄糖+NADPH2•0.5ml10mMNADP+该用户指南将演示使用EppendorfBioSpectrometer紫外/可见光分光光度计进行的酶活性测定。为优化测定流程，先使用单•1ml1mMATP波长λ-连续（Singleλ-continuous）测定法进行初步测定。然后，根据这些结果进行实际活性测定。通过线性回归确定酶活性。图2：葡萄糖或ATP的间接酶检测•1ml己糖激

8、酶两种物质可以通过己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化的偶联反•2ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶为了进行测定，使用源自面包酵母的己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行偶联反应。由于EppendorfBioSpectrometer应得以确定（偶联测试系统[1]）。通过生成的NADPH2的量来计算两种物质的量。kinetic紫外/可见光分光光度计（动力学款）带有温控比色皿槽，也可演示这一反应对温度的依赖性。在37°C时，检测到最高活性。以上溶液均使用分子生物学用水进行制备，并在