土壤酶活性测定方法

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1、土壤酶活性测定方法一、蔗糖酶:3,5-二硝基水杨酸比色法1.试剂配制(1)2N氢氧化钠200mL:称取16g氢氧化钠,用蒸馏水溶解,定溶于200mL容量瓶中。(2)3,5-二硝基水杨酸溶液1000mL:称5g二硝基水杨酸,溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中,再加300g酒石酸钾钠,用蒸馏水稀释至1000mL(不超过7天)。(3)1/15M磷酸氢二钠1000mL:23.867gNa2HPO4·12H2O溶于1000mL蒸馏水中。(4)1/15M磷酸二氢钾1000mL:9.078gKH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。(5)pH5.5磷酸缓冲液10

2、0mL:5mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M)(6)8%蔗糖1000mL:称取80g蔗糖,用水溶解,稀释至1000mL。(7)甲苯。(8)标准葡萄糖溶液(1mg/mL)1000mL:取少量葡萄糖在真空干燥箱中,于55℃条件下真空干燥至恒重。然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄糖母液(10mg还原糖/ml)。取此母液10ml,用蒸馏水定容至100mL即成标准葡萄糖液(1mg/ml);2.操作步骤(1)标准曲线绘制:分别取标准葡萄糖液0.4mL,0.8mL,1.2mL,1.6mL,2.0mL,2.8mL,3.2mL于

3、50mL比色管中,另取一管做空白对照。用蒸馏水补足至10mL。加入3.0mL3,5-二硝基水杨酸,沸水浴5min,随即在自来水流下冷却。最后用蒸馏水稀释至50mL,并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。比色后,以光密度值为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。(2)土壤蔗糖酶活性测定:称5.00g土样,置于50mL三角瓶中,注入15.0mL8%蔗糖溶液,5.0mLpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后,放入恒温箱,在37℃下培养24h。到时取出,6000rpm离心10min。取1.0mL上清液(新鲜土样所吸取的上清液体积为1.0mL;风干土

4、及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL)于50mL比色管中,然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。为消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差。每一土样需做无基质对照。整个实验需作无土壤对照。3.结果计算蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。葡萄糖(mg)=(a-b)×c式中a---从标准曲线查得的样品(加了基质)对应的葡萄糖浓度,mg/mL;b---从标准曲线查得的样品对照组的葡萄糖浓度,mg/mL;c---换算成1g土的系数。二、脲酶:靛酚比色法1.试剂配制(1)pH6.7柠檬酸盐缓冲液1L:取184g柠檬酸溶于300mL蒸馏水中,另

5、取147.5gKOH溶于水,再将两种溶液合并,用1NNaOH将pH调至6.7,并用水稀至1L。(2)苯酚钠溶液:称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中,加2mL甲醇和18.5mL丙酮,然后用乙醇稀释至100mL(A液),保存在冰箱中。称取27gNaOH溶于100mL水中(B液),保存在冰箱中。使用前,取A、B两液各20mL混合,并用蒸馏水稀释至100mL备用。(3)次氯酸钠溶液100mL:取10%的次氯酸钠溶液9mL,用水稀释定容于100mL容量瓶中,即活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。(4)10%尿素溶液500mL:取50g尿素,用水稀释至500mL。4(1)

6、甲苯。(2)氮的标准溶液1L:精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1L,则得含氮0.1mg/mL的标准液。再稀释10倍得到N工作液。2.操作步骤(1)标准曲线绘制:分别取氮的工作液1、3、5、7、9、11、13mL于50mL比色管中,另取一管做空白对照。用蒸馏水加至20mL。再加4.0mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀。20min后显色,定容。1h内在分光光度计上于波长578nm处进行比色。根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。(2)土壤脲酶活性测定:称5.00g土样,置于50mL三角瓶中,加入1.0mL甲苯。15min后加10mL10%尿

7、素液和20mLpH6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。到时取出,6000rpm离心10min。取3.0mL上清液(新鲜土样所吸取的上清液体积为2.0mL;风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL)于50mL刻度试管中,然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。3.结果计算脲酶活性以24h后1g土壤中NH3—N的毫克数表示。NH3—N(mg)=a×b式中a---从标准曲线查得的NH3—N浓度,mg/mL;b---换算成1g土的系数。三、蛋白酶:茚三酮比色法1.试剂配制(1)1%酪素溶液1000mL:取10g酪素,用1000mL

8、pH7.4的0.2M磷酸盐缓冲液稀释定容至1L的容量瓶中。(2)0

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