土壤酶活活性测定方法

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1、土壤脲酶(urease)活性的测定方法:靛酚比色法(一)方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质,酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚,颜色深度与氨含量相关,因而用于脲酶活性的测定。(二)试剂1)甲苯2)10%尿素:称取10g尿素,用水溶至100mL。3)柠檬酸盐缓冲液(PH6.7):184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并,用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释至1000毫升。4)苯酚钠溶液(1.35mol/L):62.5克苯酚溶于少量乙醇,加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮,用乙醇稀释至100毫升(A),存于冰箱中;27克NaOH溶于100毫升水(

2、B)。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合,用蒸馏水稀释至100毫升。5)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂,至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。6)氮的标准溶液:精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL,得到1mL含有0.1mg氮的标准液。(三)测定步骤(1)标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL,定容至100mL,即稀释了10倍,吸取1,3,5,7,9,11,13mL移至50mL容量瓶,加水至20mL,再加入4mL苯酚钠,仔细混合,加入3mL次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定,以标准溶液浓度

3、为横坐标,以光密度值为纵坐标绘制曲线图。(2)土壤中脲酶活性的测定称取10g土壤置于100mL容量瓶中。用2mL甲苯处理15分钟。往瓶中加入10mL10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液(pH6.7)。仔细混合后,将瓶放在37℃恒温箱中,放置3h。与此同时,进行以水代替基质,及无土壤的基质对照测定。培养结束后,用热至38℃的水稀释至刻度。摇匀,将悬液过滤。吸取1mL滤液于50mL容量瓶中,用蒸馏水加至10mL。然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂,显色,比色,最后根据标准曲线求出氨态氮含量。以每克土壤在37℃下24h内酶解尿素释放的NH3-N的毫克数来表示脲酶活性。土壤蛋白酶活性测定

4、方法:铜盐比色法(一)方法原理本法基于以精胶为基质,酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。用比色测定颜色深度,计算出氨基酸含量,来度量酶的活性。(二)试剂1)1%精胶2)甲苯3)铜-磷酸盐溶液:①27.3gCuCl2·H2O溶于1L水;②64.5gNa2HPO4·12H2O溶于500mL水,加入7.2gNaOH,稀释至1L;③57.21gNa2B4O7溶于1.5L水,加入100毫升0.1mol/LHCL稀释至2L,使用按照1:2:2的体积分数前将上述①、②、③混合。4)甘氨酸标准溶液的配制:取267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水,稀释至1L(1mL含50µgNH3-N)。(三)操

5、作步骤(1)标准曲线绘制取0、5、10、15、20mL甘氨酸标准溶液,用蒸馏水加至20mL,然后加入20mL新配制的铜-磷酸盐溶液。显色后,用分光光度计在650nm处测定,绘制标准曲线。(2)土壤蛋白酶活性测定称取5g土壤置于100mL三角瓶中,加入甲苯2mL,放置15min,加入20mL1%精胶溶液,于37℃恒温培养24h,于此同时,以水代替基质作为对照。培养结束后,将悬液过滤,取10mL滤液,加水10mL,铜-磷酸盐溶液20mL。显色后,用分光光度计在650nm处测定,根据标准曲线求出NH3-N含量。以每克土壤在37℃下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量(µg)表示蛋白酶活性

6、。土壤磷酸酶测定方法:磷酸苯二钠法(一)方法原理本法基于以磷酸苯二钠为基质,酶解释放出的酚,使其与氯代二溴对苯醌亚胺试剂反应生色。用比色法测定出游离的酚量,用以表示磷酸酶活性。(二)试剂配制1)0.5%磷酸苯二钠(用缓冲液配制);2)pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液;3)氯代二溴对苯醌亚胺试剂:取0.125g2,6-二溴苯醌氯酰亚胺,用10mL96%乙醇溶解,贮于棕色瓶中,存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用;4)酚的标准溶液:酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中,稀释至1L,贮于棕色瓶中;酚工作液——取10mL酚原液稀释至1L(每毫升含0.0

7、1毫克酚);5)甲苯;6)0.3%硫酸铝溶液。(三)操作步骤(1)标准曲线绘制取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液,置于50mL容量瓶中,每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂,显色后稀释至刻度,即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg·g-1浓度的酚标准溶液梯度。30min后比色测定。绘制标准曲线。(2)土壤磷酸酶的测定称取5g风干土置于200mL三角瓶中,加2

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