鸡免疫球蛋白G（IgG）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究

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1、鸡免疫球蛋白G（IgG）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用预期应用ELISA竞争抑制法定量测定鸡血清、血浆或其它相关液体中鸡免疫球蛋白G（IgG）含量。实验原理本试剂盒应用竞争抑制酶标免疫分析法测定标本中待测物质水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被抗体的微孔中同时加入酶标的抗原和待测抗原，被测抗原与酶标记抗原对特异性抗体进行竞争结合。经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。待测标本浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相

2、关，而与样品中待测物质含量呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1.酶联板：一块（96孔）标准品（冻干品）：2瓶（200ul/瓶），每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为50ug/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释成50ug/ml，25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.12ug/ml，1.56ug/ml，0.78ug/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0ug/ml，临用前15分钟内配制。如配制25ug/ml标准品：取

3、0.5ml50ug/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。2.样品稀释液：1×20ml/瓶。3.检测溶液A：2×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔50ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。4.检测稀释液A：2×10ml/瓶。5.底物溶液：1×10ml/瓶。6.浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

4、7.终止液：1×10ml/瓶（2NH2SO4）。标本的采集及保存1．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。2．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。操作步骤实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行

5、稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。用离心管稀释标准品以及样本，分别加标准品或待测样品50ul，然后立即每管加检测溶液A工作液50ul，轻轻振动，混匀。混匀后加入酶标板，每孔100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。2.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。3.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟以内，此时肉眼可见

6、标准品的后3-4孔有明显的梯度兰色，前3-4孔梯度不明显，即可终止）。4.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。5.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。注：1．每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。3.未使用完的酶标板

7、或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、检测溶液A工作液工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液。4.建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。特异性本试剂盒可同时检测天然的鸡免疫球蛋白G（IgG），且与其它相关蛋白无交叉反应。计算以标准物的浓度为

8、横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓