色谱柱常用知识

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1、色谱柱使用常识1.色谱柱的安装⑴、用过滤和脱气的流动相（不含缓冲盐）彻底冲洗色谱仪的泵和管路，务必使系统中不含气泡。⑵、根据色谱柱上所标示的流动相流向，将色谱柱入口与泵端管路相连，柱出口不连。⑶、将泵的流速设为0.1mL/min或更低，流速缓慢地上升到正常流速（t>5min）。⑷、当溶剂从色谱柱出口端自由流出时，将流速设为0，把柱出口与检测器端的管路相连。⑸、用10－30倍柱体积的流动相、正常流速平衡色谱柱。⑹、氨基柱、氰基柱既可在正相环境下使用，也可在反相环境下工作。当需要从反相变为正相或正相变为反相时，需要用20－30倍柱体积

2、的THF作为过渡溶剂冲洗系统，否则易使泵的单向阀堵塞，出现压力异常的现象。2.色谱柱使用注意事项①、流动相：a、溶剂必须是HPLC级的，试剂则尽可能使用高纯度的；b、不与固定相发生化学反应，粘度小，且对样品有适宜的溶解度，要求k在1～10范围内（可用范围）或2～5（最佳范围），k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀；c、流动相使用之前必须过滤和脱气；d、确保溶剂间是相互混溶的；e、流动相必须与检测器相匹配，如用紫外检测器时，不能选用截止波长大于检测波长的溶剂。痕量的杂质会极大地降低色谱柱的性能，当需要更换流动相时

3、，确保溶剂（缓冲液）之间是相互混溶的。若使用的溶剂与色谱柱中的溶剂不能混溶，则需使用过渡溶剂，否则会对色谱柱产生永久性的伤害。盐或缓冲液从流动相中析出也会对色谱柱产生永久性的伤害。每次进样前应该检查样品在流动相中的溶解性，如果可能尽量使用流动相溶解样品。②、固定相：a、流动相的pH值应保持在2.0－8.0之间（除非有特殊说明）；b、如果有必要可使用预饱和柱和保护柱；c、使用氨基柱时，流动相和样品中尽量避免含醛类和酮类物质。当前的反相色谱柱填料可分为以下三种：⒈硅胶柱：柱效高，机械强度大，但对pH敏感，低pH值(<2.0)会使键合相

4、水解（除去键合的功能集团）；高pH值（>8.0），硅胶溶解。如果流动相的pH值接近2.0或8.0，需要使用预饱和柱。⒉有机聚合物填料：在宽pH范围内稳定，残留硅羟基效应较小；但其柱效低，机械强度不高，在不同的溶剂中可能缩水或溶胀。在应用过程中，压力绝对不能超过其最大能承受的限制，且流动相中有机溶剂如甲醇、异丙醇、乙醇的含量不能超过10％。⒊有机－无机杂化粒填料：新开发的一种新型填料，由两种高纯的单体（有机聚合物和无机硅烷）合成的高纯度填料，此类填料将硅胶填料和有机聚合物填料的优点有机地结合起来，柱效高、机械强度高、稳定性好、pH范

5、围宽，特别是表面和颗粒内部的硅羟基大部分被有效的屏蔽，使其对碱性物质的保留性能非常好。③、背压（backpressure）和流速：a、保持背压低于3500psi（245bar）；b、避免任何突然的压力变化；c、如果背压高（>3500psi），可反冲色谱柱，但流速应为正常流速的1/5-1/2；d、如果检测池需要除气，可以使用背压调控器（backpressureregulator）。为最大限度的延长色谱柱的寿命，可根据色谱柱的填料的粒径、色谱柱的内径对流速进行调整，使得背压<3500psi。如果背压不超过界限，色谱柱的流速可任意设定表

6、1粒径、内径、流速和背压之间的关系粒径（µm）内径（mm）流速（mL/min）150mm250mm34.60.5985164051.00.11500250052.00.2750125053.20.5732122654.61.07101180510.05.07501250104.62.03555901021.220.0170280④、上样量：色谱柱的最大载样量取决于柱子的尺寸、使用的条件和样品的类型，因此很难给出一个明确的值。而最大进样体积则比较容易确定（见表中的典型值）。进样体积太大或样品浓度过高会使得峰展宽或峰融合。表2柱尺寸与

7、最大上样体积柱尺寸（长度*内径）最大上样体积250×2.0mm10μL200×3.0mm15μL250×4.6mm50μL250×10.0mm250μL⑤、参数的缩放：为保持保留时间的重现性，可根据色谱柱内径的不同来调整流速和上样量。2Scalefactor（缩放因子）＝（radiuscolumnB/radiuscolumnA）表3内径与缩放因子间的换算（以4.6mm内径的色谱柱为标准）内径（mm）缩放因子1.00.052.00.23.20.510.05.021.221.0⑥、柱温：大多数分离工作是在室温下进行的，如果实验室的温度

8、保持不变的话没什么问题，但大多数工作环境的温度会有波动，这对方法的实验室间重现性非常不利。温度对等度分离的保留时间有影响，一般来说，每增加1℃，保留时间就减少1－3％。即使在温度控制、日夜恒温的环境下，由于昼夜温差的影响，室温也会发生较大的变化，特