雀形目38种鸟类线粒体cytb的引物设计及PCR优化

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1、第30卷第6期林业科技Vol.30No.62005年11月FORESTRYSCIENCE&TECHNOLOGYNov.2005文章编号:1001-9499(2005)06-0029-04雀形目38种鸟类线粒体cytb的引物设计及PCR优化马玉国会艳牛黎明(东北林业大学野生动物资源学院,黑龙江哈尔滨150040)摘要:通过设计雀形目鸟类线粒体细胞色素b的通用引物并对其PCR反应体系进行优化,确定了雀形目38种鸟由基因组DNA扩增线粒体细胞色素b基因全序列的最佳反应条件。在10μl最佳反应体系中,dNTP浓度

2、为100μM,引物浓度100nM,退火温度范围为51～55℃,模板量在50～150ng之间,扩增反应效果最好。在上述最佳反应体系和条件下获得的目的条带清晰、明亮,可应用于雀形目鸟类分子系统学研究。关键词:引物设计;PCR优化;雀形目鸟类;细胞色素b+中图分类号:Q9591739;Q95-336文献标识码:A雀形目鸟类是鸟纲中最大的一个类群,有关影响,而任何研究都要根据具体需要对反应条件该类群的起源以及演化关系,一直是鸟类学界关进行优化,所以,本文针对这些因子来探讨和优[1]注的焦点问题。分子系统学在解决各

3、种生物类化雀形目38种鸟类细胞色素b的最佳扩增反应条群起源和演化方面具有非常大的优势,许多有争件,以便为该基因的克隆、测序等后续研究工作议的问题可通过分子手段加以解决。然而,与雀奠定基础。形目鸟类相关的分子生物学研究还很薄弱,相应1材料与方法的分子系统工作开展得也不多,这些都影响了该类群系统学问题的解决。111材料聚合酶链式反应(PCR)已广泛应用于分子本试验共涉及雀形目鸟类38种,收集于东北生物学的各个领域。成功的一次PCR扩增,需要林业大学帽儿山鸟类环志站,均为鸟类环志过程许多因素的精确控制,其扩增情

4、况不仅受扩增目中自然死亡的个体(表1)。标序列DNA模板的影响,还与扩增体系和条件有试验所用Taq酶、dNTP等PCR试剂购于哈尔关。由于PCR反应影响因子众多,包括dNTP浓滨伊事达生物工程有限公司,引物由上海博亚生度、引物浓度、模板量变化等均对扩增结果产生物技术有限公司合成。表1检测的物种中文名学名数量中文名学名数量普通朱雀Carpodacuserythrinus1斑鸫Turdusnaumanni1金翅雀Carduelissinica1蓝歌鸲Lusciniacyane5红腹灰雀Pyrrhulapyrr

5、hula7红胁蓝尾鸲Tarsigercyanurus6长尾雀Uragussibiricus7灰背鸫Turdushortulorun3白腰朱顶雀Cardeulisflammea6栗耳巫鸟Emberizafucata6燕雀Fringillamontifringilla5栗巫鸟Emberizarutila2北朱雀Carpodacusroseus7白眉巫鸟Emberizatristrami5黄雀Cardeulisspinus5田巫鸟Emberizarustica7红尾伯劳Laniuscristatus1黄喉巫鸟E

6、mberizaelegans8普通币鸟Sittaeuropaea1苇巫鸟Emberizapallasi2棕头鸦雀Paradoxorniswebbianus1灰头巫鸟Emberizaspodocephala7家燕Hirundorustica1北灰翁鸟Muscicapadauurica4银喉长尾山雀Aegithaloscaudatus5暗绿柳莺Phylloscopustrochiloids4大山雀Parusmajor7巨嘴柳莺Phylloscopusschwarzi1煤山雀Parusater2褐柳莺Phyll

7、oscopusfuscatus1沼泽山雀Paruspalustris5矛斑蝗莺Locustellalanceolata2褐头山雀Parusmontanus3鳞头树莺Urosphenasquameiceps2棕眉山岩鹨Prunelamontanella3黄腰柳莺Phylloscopusproregulus7锡嘴雀Coccothraustescoccothraustes2黄眉柳莺Phylloscopusinornatus730林业科技第30卷112试验方法入一滴矿物油,以防液体挥发。运行以下PCR程11211

8、DNA提取序:取鸟的肌肉组织少许,将其剪碎后用经典的预变性94℃,5min;变性94℃,45s;复性[3]酚-氯仿法提取总基因组DNA。53℃,45s;延伸72℃,90s;30次循环;后保温11212DNA浓度和纯度测定72℃,10min。将提取的DNA用DU640核酸蛋白分析仪进行1121412退火温度测定,根据A260/A280的比值判别所提取的DNA以北灰翁鸟的3份样品做模板DNA,在梯度纯度,利用260nm下的OD值计