降解2,4-二氯酚微生物的分离及其2,4-二氯酚羟化酶基因的克隆和表达

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1、!"卷!期生物工程学报%&’(!")&(!!""#年$月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12*+,-.!""#!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!降解!，"#二氯酚微生物的分离及其!，"#二氯酚羟化酶基因的克隆和表达2!$#!"钟文辉孙明何国庆冯孝善喻子牛（2南京师范大学化学与环境科学学院，南京!2""63）（!华中农业大学生命科学技术学院，武汉#$""3"）（$浙江大学生物系统工程与食品科学

2、学院，杭州$2""!6）（#浙江大学环境与资源学院，杭州$2""!6）摘要从土壤中分离到一株降解!，#/二氯酚能力较强的细菌菌株B4!#2/2，经鉴定该菌株属于假单胞菌属。菌株B4!#2/2在最适条件下能在#0.内将6"8CDE的!，#/FGH降解62I，能利用!，#/二氯酚、!，#/二氯苯氧乙酸、苯甲酸和儿茶酚为唯一碳源生长。采用J&>K.5,A杂交对!，#/二氯酚羟化酶基因（3045）定位后构建基因组文库，再用斑点杂交筛选目的转化子，克隆了该菌株的3045。序列测定得知含3045的亚克隆片段全长!$

3、06?=，其中3045基因编码区2363?=。核苷酸和氨基酸序列分析表明，3045与已在B5AL+AM登记的相关基因有一定的差异。3045基因能够在大肠杆菌转化子中成功地表达有生物活性的酶。关键词假单胞菌，!，#/二氯酚，!，#/二氯酚羟化酶基因，基因克隆中图分类号N6$文献标识码O文章编号2"""/$"1（2!""#）"!/"!"6/"1［P］!，#/二氯酚（!，#/FGH）通常用于生产五氯酚、!，不同的酶先后催化生成!/氯马来乙酸。其中!，#/#/二氯苯氧乙酸（!，#/F）和!，#，P/三氯苯氧乙酸

4、等二氯酚羟化酶基因（本文取代号为3045）是降解!，氯代芳香化合物，这些化合物被广泛用作木材防腐、#/FGH的关键基因之一。!，#/二氯酚羟化酶也参与防锈剂、杀真菌剂和一般杀虫剂等。!，#/FGH广泛对!，#/F的降解。根据对!，#/F降解基因的研［PQ3］存在于以上氯代芳香化合物的生产废水中，此外也究，编码!，#/二氯酚羟化酶的基因（/-3.）长度约存在于染料和增塑剂等的生产废水中。!，#/FGH及为2R0M?。笔者从生产!，#/FGH的排污口土样中分其衍生物都是有毒、难降解化合物，是环保中需要控离到

5、几株具有降解!，#/FGH能力的微生物，对这些制的一大类污染物。美国、中国等国家已把!，#/FGH菌株的生物学特性和对氯代芳香化合物的降解和利列入水中有害物质或优先污染物“黑名单”。分离筛用能力进行了研究，并从其中一株降解!，#/FGH能选降解!，#/二氯酚的微生物，对其特性、降解基因直力最强的细菌菌株中克隆出降解!，#/FGH的几个关至构建基因工程菌的研究具有重要的理论和现实意键基因，对所克隆的基因序列作了测序和分析，也对义。目前国内外对!，#/FGH的厌氧生物降解进行了基因在大肠杆菌是否表达进行了研

6、究。这些研究为［2Q!］广泛的研究，也有对!，#/FGH降解菌的特性和后续进一步构建降解!，#/FGH的基因工程菌奠定了［$Q#］降解酶定域及活性的报道，但对微生物的!，#/基础。FGH降解基因的结构和分子特征的研究报道不多。$材料与方法在好氧生物降解过程中，!，#/FGH先经!，#/二氯酚羟化酶催化生成$，P/二氯儿茶酚后，进一步由$，P/$%$微生物菌株二氯儿茶酚2，!/双加氧酶催化将苯环裂开生成!，#/$%$%$降解!，#/FGH细菌菌株的分离筛选和鉴定：二氯/顺，顺/粘康酸，此中间代谢产物再经其

7、它三种从生产!，#/FGH及!，#/F的化工厂的排污口取土收稿日期：!""$/"0/!1，修回日期：!""$/2!/23。基金项目：国家自然科学基金资助项目（)&($""0""2$）和教育部农业微生物重点开放实验室开放基金资助项目。"通讯作者。45’：01/!3/03$61"$"；7/8+9’：:;#2<=>?’9-(@?(.?(-A!04生物工程学报!4卷样，添加!，"#$%&驯化’个月后分离!，"#$%&降解2(J预杂交(N，再加入探针于2(J杂交!4N，再洗膜［(］菌株。根据细菌分类手册对分离到的

8、细菌进行形和显色。斑点杂交参照文献［04］。态观察和生理生化试验，再根据《伯杰氏细菌鉴定手!"%"+大肠杆菌质粒的抽提、$)*的体外重组操册》鉴定到属。作、大肠杆菌的常规转化：均参照文献［04］。$)*!"!"#$)*操作的受体菌株：大肠杆菌$+,!。的酶切和连接等操作均按酶的供应商推荐的方法。!"#培养基!"*!"#$基因序列及,-./0123杂交探针序列测定无机盐培养基（-.）配方按文献［/］，无机盐固请专业公司测定。体培养基则另添加优