离子液体1_丁基_3_三甲基硅咪唑六氟磷酸盐萃取细胞色素C

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1、第36卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第9期2008年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1187～1190离子液体12丁基232三甲基硅咪唑六氟磷酸盐萃取细胞色素C3程德红陈旭伟舒杨王建华(东北大学分析科学研究中心,沈阳110004)摘要建立了疏水性离子液体12丁基232三甲基硅咪唑六氟磷酸盐(BtmsimPF6)萃取细胞色素C(Cyt2c)的新方法。在萃取条件为pH1.0,Cyt2c溶液体积3mL,BtmsimPF6体积400μL,萃取时间30min时,5mg/LCyt2

2、c的萃取效率为85%。萃取机理研究表明:在酸性条件下,Cyt2c发生构型转变,肽链伸展,使疏水性基团外露,增加了Cyt2c在疏水性离子液体中的溶解性;同时,当pH<2.0时,血红素基团中的Fe与Met280的配位断裂,空出第六个配位空间,离子液体咪唑阳离子进入到肽链孔穴与Fe发生配位,形成新的配位键,从而被萃取到离子液体中。关键词细胞色素C,离子液体,萃取,机理1引言[1～3][4,5]离子液体(IL)作为绿色溶剂可代替传统的有机溶剂而广泛应用于有机合成、萃取分离电[6～8][9～11]化学等领域。近年来,离子液体在生物大分

3、子萃取分离中的应用引起了广泛关注。以离子液[12]体代替传统溶剂不仅显著降低了危害和污染,同时有利于保持生物大分子的活性。在分析实际样品中的蛋白质时,基体组分可能产生严重干扰。因此,从复杂样品基体中获得纯净的蛋白组分,去除基体[13][14]干扰至关重要。目前,常用于蛋白质萃取分离的方法主要有反胶团法、微流控芯片法及微乳液[15]法等。但是,在这些分离方法中,需使用丙酮、苯酚等有毒、易挥发的有机溶剂。文献中有采用离子液体代替传统有机溶剂萃取蛋白质的报道,但须加入冠醚等辅助萃取剂,使蛋白与冠醚形成配合物而被[16]萃取到离子液

4、体中。细胞色素C(Cyt2c)是一种涉及体内电子转移的重要蛋白质。本实验采用疏水性离子液体,通过调节溶液pH值,无需引入任何辅助萃取剂,即可有效地将Cyt2c萃取到离子液体相中。在适当酸度条件下,以二次去离子水作为反萃取溶剂,可将Cyt2c从离子液体中反萃取出来。2实验部分2.1仪器与试剂紫外2可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);JascoJ2810CD光谱仪(日本分光公司);BrukerAvance500型核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司)。细胞色素C(Sigma公司);三甲基硅咪唑(临海市凯乐化工厂);氯代正

5、丁烷(北京化学试剂厂);甲苯(国药集团化学试剂公司);乙酸乙酯(国药集团化学试剂公司);六氟磷酸(昆山精细化工有限公司)。用1.0mol/LHCl调节溶液pH值。2.2实验方法将3mLCyt2c水溶液调节到pH1.0～5.0,与400μL离子液体混合,涡旋振荡30min后离心分离。取上层水相测定406nm处的吸光度,计算萃取效率。将离子液体相与3mL二次去离子水混合,控制pH7.0,涡旋振荡30min后离心分离,取上层水相测定吸光度,以进入离子液体的Cyt2c为基准,计算反萃取效率。[17]2.3离子液体的合成向500mL三

6、口烧瓶中加入100mL三甲基硅咪唑和145mL氯代正丁烷,再加入50mL甲苯,在氮气保护下水浴加热到85℃并搅拌,回流72h,反应产物用50mL乙酸乙酯洗涤3次,在80℃下干燥2007211211收稿;2008202217接受本文系国家自然科学基金重点项目(No.20635010)、国家杰出青年科学基金(No.20725517)资助课题3E2mail:jianhuajrz@mail.neu.edu.cn1188分析化学第36卷24h,得浅黄色液体12丁基232三甲基硅咪唑氯代盐(BtmsimCl)。在500mL塑料烧瓶中,加

7、入100mL上述氯代离子液体和100mL水,将120mL六氟磷酸在搅拌中缓慢滴入。控制反应温度不超过50℃,并继续搅拌1h,用去离子水将离子液体相洗涤至pH6.5左右,80℃下干燥24h,即得12丁基232三甲基硅咪唑六氟磷酸盐(BtmsimPF6)离子液体,产率约为85%。所1得产品的核磁共振氢谱为:H2NMR((CD3)2CO溶剂,TMS内标):0.46(s,9H),0.889(t,3H),11324(m,2H),1.868(m,2H),4.34(m,2H),7.512(d,1H),7.674(d,1H),8.71(d,

8、1H)。3结果与讨论3.1Cyt2c浓度对萃取的影响考察了离子液体对5～30mg/LCyt2c的萃取效率。将3mLCyt2c水溶液调至pH1.0,与400μL离子液体混合振荡30min,取上层水相测定吸光度值。结果表明,5mg/LCyt2c的萃取效率为85%。但随着浓度增大,萃取效率呈下降