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《甲胎蛋白干血滤纸免疫放射分析试剂盒的研制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第11卷第3期同 位 素Vol.11No.31998年8月JournalofIsotopesAug.1998甲胎蛋白干血滤纸免疫放射分析试剂盒的研制陈 键 刘一兵 韩世泉 王衍真(中国原子能科学研究院同位素研究所,北京102413)125用氯胺T法制备I2AFPMcAb,用AFPMcAb包被试管,以全血作标准,建立了AFP干血滤纸片免疫放射分析方法。该方法灵敏度为712LgöL,批内变异系数为511%—1010%,批间变异系数为417%—816%,正常参考值≤10LgöL,与血清AFP免放分析方法比较,相关系数r=0.979。关键词 甲胎蛋
2、白(AFP) 干血滤纸 免疫放射分析 单克隆抗体(McAb)中图法分类号R730.45R817[1]肝癌是常见的恶性肿瘤之一,每年新发病例11102万,在我国一些地区发病率较高。目[2,3]前尚缺乏一种准确、快速的普查手段。AFP是原发性肝癌的重要标志物,早已广泛用于临床诊断、治疗和研究。目前国内对AFP的测定大多采用放射免疫分析方法,需要抽取患者的静脉血作为标本,不利于对肝癌的大面积筛查,尤其是无条件开展放免工作的边远地区。由于AFP干血滤纸片免疫放射分析法只需采少量耳垂血点于特制滤纸片上,阴干后可将样品寄给检测中心进行集中检测;且该方法
3、采用固相包被管进行分离,很大程度上简化了操作步骤。为此,拟建立AFP干血滤纸片免疫放射分析方法。1 材料和方法111 主要试剂125采用新生儿脐带血配制AFP标准。SephadexG225:瑞典Pharmacia产品。NaI:杜邦公司产品。包被用试管(Á12mm×60mm,底六角):黄岩医用塑料厂产品。采血滤纸(8402型):天津造纸研究所产品。其它化学试剂均为分析纯。112 试剂盒组份的制备12511211 试剂盒组成 由AFP标准纸片、I2AFPMcAb、AFPMcAb包被管、高浓度洗涤液、采样滤纸等组成。11212 抗AFPMcAb的
4、制备 取经AFP免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2öO,在50%陈 键:男,26岁,助理工程师,放射免疫专业收稿日期:1997211226 修改稿收到日期:1998203213 第3期 陈 键等:甲胎蛋白干血滤纸免疫放射分析试剂盒的研制135PEG(聚乙二醇)作用下进行融合,铺于96孔板,置5%CO2培养箱中37℃培养,当细胞群落长至1ö3孔大小时,用RIA方法筛选。将呈抗体阳性的细胞按有限稀释法进行克隆化至所有细胞孔均呈抗体阳性为止。将克隆化成功的杂交瘤细胞扩大培养,注入已用降植烷处理的小鼠腹腔,一周后收取腹水。[4]11
5、213 抗AFPMcAb的提纯 取小鼠腹水与2倍于腹水体积的0106molöLpH5.0的乙酸缓冲液混和,pH调至418。室温搅拌状态下逐滴加入辛酸(每毫升加入25LL辛酸)。再搅拌30min,11000römin离心30min,取其上清液对0105molöLpH714磷酸盐缓冲液透析,用紫外光吸收法测其AFPMcAb的浓度。12511214I2AFPMcAb的制备 采用氯胺T法对AFPMcAb进行碘标记,标记率为80%—90%,经SephadexG225柱层析分离纯化,放化纯度>90%,比活度为740GBqög。11215AFP标准纸片的
6、制备 将加过抗凝剂的健康人全血离心,取血球并用生理盐水洗涤三次。将血球与小牛血清按一定比例混匀,并加入脐带血配成AFP浓度分别为0、10、30、100、200、400、800LgöL的标准品,分别取30LL点于滤纸上,室温下阴干后,-20℃冷冻贮存。11216AFPMcAb包被管的制备 用011molöLpH9.5的碳酸盐缓冲液配制成AFPMcAb包被液,将包被液加入试管4℃过夜,第二天用含1%BSA、0102molöLpH7.4的磷酸盐缓冲液封闭,并加入保护剂保护,4℃保存。113 操作方法实验用试管(除T管)均用试剂盒配备包被管。标准品
7、和样品滤纸用Á6mm打孔钳将干血片打入试管。按表1加样。洗涤三次后,用吸水纸吸干试管口残液。测各管放射性计数。表1 试剂盒分析程序试管组T管标准管样品管标准1片样品1枚125I2AFPMcAb2502502504℃过夜,倒出管内纸片洗涤液500500114AFP测定的影响因素11411 提取缓冲液的选择 配制AFP浓度分别为0LgöL和600LgöL的全血,并加入一定125量的I2AFP,混匀。以每点30LL点于滤纸上,室温下阴干。分别用不同浓度不同pH的磷酸盐缓冲液4℃过夜提取。第二天挑去纸片,测各管内液体的放射性计数,以对比不同缓冲液的
8、提取效果。12511412 纸片均匀度和提取率的测定 用I2AFP作示踪剂,分别配制AFP浓度为0LgöL和700LgöL。血球体积百分含量为50%的全血,随机抽取10张纸片,以
