细胞划痕实验

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1、·128·中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2010Jan;26(1):128～31◇实验方法学◇肿瘤细胞迁移过程的动态评估方法胡剑江，雷洪涛，侯燕鸣，王毅(中国中医科学院医学实验中心形态学实验室，北京100700)中国图书分类号:R284.1;R329.24;R73-351;R730.3进，并用肺癌细胞株A549细胞作为观测对象，用小檗碱作为文献标识码:A文章编号:1001－1978(2010)01－0128－04模式药物，Rg3作为阳性对照对细胞迁移进行干预

2、，从细胞摘要:目的建立肿瘤细胞迁移过程的多角度、实时动态、定迁移过程的速度、距离、细胞增殖等方面进行分析，进而建立量评估方法。方法建立细胞迁移观测模型，分别加入小檗细胞迁移定量评估的方法，该方法简便实用，可推广到正常碱及Rg3培养24h，用活细胞工作站随机选取8个不同观测细胞迁移研究领域。点，连续观测24h。所取得的数据从迁移面积、距离、单个细1材料与方法胞迁移速度、单位面积细胞增殖数量等多角度进行分析。结1.1材料活细胞工作站(IX81倒置荧光显微镜及ZDC自果该方法可以长时间观察划痕内细胞的迁移过

3、程;小檗碱动对焦系统，日本Olympus;细胞培养小室，日本Tokaihit;Q-高、中剂量组(25，12.5μmol·L－1)可抑制A549细胞的迁移imagingCCD及ImageProPlus6.2分析软件，美国MediaCy-过程(P<0.01)，且迁移面积、距离、速度及细胞增殖数量4bernetics);人肺癌细胞株A549(北京中医医院惠赠);小檗项指标的结果基本一致，人参皂苷Rg3(0.1mmol·L－1)可碱(购于中国药品生物制品检定所);人参皂苷Rg3(吉林亚以在各时间点(6，12，

4、24h)抑制细胞迁移速度(P<0.01)，泰制药股份有限公司生产，参一胶囊每粒含人参皂苷Rg31024h可抑制细胞迁移面积及距离(P<0.01)，但可促进细胞mg)，激光共聚焦用直径35mm，底厚0.17mm玻璃底小皿增殖(P<0.01)。结论该方法灵敏、简便、快速，可广泛应(北京生友公司，北京);RPMI1640培养基(美国Gibico);HEPES、丙酮酸钠、谷氨酰胺、胰蛋白酶(Sigma，美国);青霉用于细胞迁移过程的动态观察。素、链霉素(华北制药厂);碳酸氢钠(北京益利精细化学品有限公司)关键

5、词:细胞迁移;活细胞工作站;细胞划痕;动态观察;小檗1.2方法碱;Rg31.2.1A549细胞划痕模型的制作及观测将常规培养的A549细胞胰蛋白酶消化后用RPMI1640培养液调整细胞浓肿瘤细胞迁移是恶性肿瘤最重要的特征之一，瘤细胞由8－1度至1×10个·L置于共焦用玻璃底小皿中每皿2ml，培其原发部位侵入血管或淋巴管或体腔，部分细胞被血液、淋养至细胞铺满小皿底部80%后，加入高、中、低不同浓度小巴液带到另一部位或器官，在该处繁殖生长，形成与原发瘤－1［8，9］［1～3］檗碱(25、12.5、6.25

6、μmol·L)或Rg3(0.1mmol·同样类型的肿瘤，这一过程即为肿瘤的侵袭和转移。－1［10］L)，对照组加入同体积的生理盐水。培养24h后，弃目前检测肿瘤细胞迁移的方法主要有细胞划痕实验及去培养基，用RPMI1640培养液洗3次，用尖端粗细相同的Trans-Well小室迁移实验，传统的细胞划痕实验需要连续观10μl枪头划数条直线，清洗2～3次去除刮起的漂浮细胞后测以评估药物对细胞迁移的作用，因此，其面临的最大的问放到活细胞工作站中，随机选取8个视野进行连续观测，每题是不能保证每次观察的都是同一位

7、点，对结果不能进行定隔10min采集图像1次，连续观测24h。量分析，也不能区分划痕内的细胞是迁移还是增殖的而来1.2.2数据分析处理在活细胞工作站中观察24h后，将［4，5］的。而Trans-Well小室迁移实验虽能定量检测细胞迁移所得序列图像数据用ImageProPlus6.2进行分析处理，主的数量，但不能直观观测细胞迁移过程，也不能将迁移和增要从以下四个方面进行分析:殖细胞区分出来，而且其价格昂贵，不适合抗肿瘤细胞迁移1.2.2.1迁移面积法如Fig1A所示，测量出不同时间点［6，7］药物的大规

8、模筛选。划痕内空白面积的大小，并用以下公式计算迁移面积:迁移在本研究中，我们在细胞划痕实验的基础上进行了改面积(nh)=空白面积(0h)－空白面积(nh)，进而比较不同剂量小檗碱组与阴性和阳性对照不同时间迁移面积的大小。收稿日期:2009－10－11，修回日期:2009－11－301.2.2.2边缘迁移距离法如Fig1B所示，在划痕每侧边基金项目:国家自然科学基金资助项目(No30600842);中国财政部自主选题资助项目(Nozx-zzxt-2006-