肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义

《肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响（细胞划痕法）实验导读瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。图1肿瘤转移示意图根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属

2、单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在

3、移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入

4、药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。下图即为划痕实验的示意图，图中可见，在细胞层上出现一道空痕（A），当加入药物后，由于药物的作用使细胞迁移受到抑制(B)，而未加入药物的细胞保持了原有的迁移能力，在一段时间后通过迁移将划痕掩盖(C)。ABC图2实验结果（A表示在单层细胞上划出的一道痕；B表示加入抑制剂，为阳性对照组；C表示未加入抑制剂，为阴性对照组）一、实验目的1．了解肿瘤细胞转移的基本原理2．了解测定细胞运动特性的方法――细胞划痕法二、实验原理肿瘤细胞在体外仍具有迁移的能力，本实验借鉴体外细胞致伤

5、愈合实验模型，利用细胞划痕法测定了肿瘤细胞的运动特性。三、仪器和试剂1）细胞系及其培养：肝肿瘤细胞HepG22）24孔板，移液器，倒置显微镜，3）主要试剂：PBS，DMEM培养液，0.25%胰酶，胎牛血清，5-氟尿嘧啶溶液（1ug/ml）四、实验步骤1.5-氟尿嘧啶溶液的配制精密称取10mg用灭菌蒸馏水溶解，定容于100ml容量瓶，精密移取1ml溶液，稀释至100ml，即得1ug/ml5-氟尿嘧啶溶液。2．制备单层细胞将细胞密度为5~10×105个/mL的HepG2细胞铺于24孔板（每孔500uL

6、）上，加入含10％胎牛血清的RMPI.1640培养液，培养16~24h,使形成单层细胞。3．划痕以五氟尿嘧啶（5－Fu）为例，首先配制1μg/μL的母液，取45μL该母液用PBS稀释至1.1mL，得到浓度为40μg/ML的5－Fu溶液。用10uL移液枪枪头（或者无菌牙签）在单层细胞上呈“一”字划痕，用PBS清洗3次，然后加入上面配好的5－Fu溶液，平行两个样本，孵育24h后换成含10％胎牛血清的RMPI.1640培养液，孵育24h。4．观察并拍照吸去培养液，用PBS清洗3次后，在倒置荧光显微镜下观

7、察并拍照。五、注意事项：1．实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。1．在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。2．在药物的筛选过程中，其对细胞迁移能力的影响也是重要的一方面。实验设计过程中需要选择适当的阳性对照组和阴性对照组。六、思考题1.如何用实验验证化学物质能恢复或者增强细胞的迁移能力？2.如何避免化学物质浓度过高造成的细胞毒性对实验的影响？七、参

8、考文献：1．司徒镇强，吴军正；《细胞培养》；兴界图书出版公司；2004年3月第1版2．MaryBirch,StephenMitchell,andIanR.Hart.IsolationandCharacterizationofHumanMelanomaCellVariantsExpressingHighandLowLevelsofCD44.CANCERRESEARCH1991;51:6660-6667.3．何贤峰，杨述华等.唑来膦酸对骨肉瘤细胞生物学行为的影响.肿瘤防治研究2008;