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《层析凝胶DEAESepharoseFastFlow分离纯化5_混合脱氧单核苷酸》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、层析凝胶DEAESepharoseFastFlow分离纯化5’2混合脱氧单核苷酸3王光柱,陈枢青(浙江大学药学院生物制药研究室,杭州310031)摘要:目的针对5’2混合脱氧单核苷酸的理化特性,研究利用DEAESepharoseFastFlow凝胶分离纯化5’2混合脱氧单核苷酸。方法上样缓冲液采用20mmol/LTris,pH9.0,上柱量≤7.5mg/mL·gel,上柱流速5mL/min,洗脱缓冲液采用20mmol/LTris+0.025mol/LNaCl,pH9.0,洗脱流速0.5mL/min。结果实验结果发现dCMP,dAMP,dTMP的收率为95%以
2、上,dGMP的收率为85%以上,所获得的混合脱氧单核苷酸经高效液相色谱检测色谱纯达98%以上。关键词:混合脱氧单核苷酸;DEAESepharoseFastFlow;收率;纯度中图分类号:TQ464.3文献标识码:A文章编号:100727693(2007)0120017204Purificationof5'2deoxynucleotidesbyDEAESepharoseFastFlow3WANGGuang2zhu,CHENShu2qing(DepartmentofBiochemistry,CollegeofPharmaceuticalSciences,Zhej
3、iangUniversity,Hangzhou310031,China)ABSTRACT:OBJECTIVEAccordingtothephysicalandchemicalcharacteristicof5'2deoxymononucleotides,thisstudyinvestiga2tedtheseparatingandpurifying5'2deoxymononucleotidesbyDEAESepharoseFastFlow.METHODSTake20mmol/LTris(pH9.0)asbindingbuffer,samplebinding≤7
4、.5mg/mL·gel,flow2rate5mL/min;Take20mmol/L,0.025mol/LNaCl(pH9.0)aselutionbuffer,flow2rate0.5mL/min.RESULTSThechromatographicgradepurityoftheeluateisabove98%byHPLC,therecoveryrateofdCMP,dAMPanddTMPisabove95%,therecoveryrateofdGMPisabove85%.KEYWORDS:5'2deoxymononucleotides;DEAESepharo
5、seFastFlow;recoveryrate;purity5’2混合脱氧单核苷酸是由脱氧核糖腺嘌呤核苷酸提供,纯度为66.67%。标准品:dCMP,dAMP,dTMP,dGMP(dAMP),脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸(dGMP)、脱氧核糖胞嘧啶购自上海秋之友生物技术有限公司。769活性炭购自上海活核苷酸(dCMP)和脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)四种脱性炭有限公司。层析凝胶DEAESepharoseFastFlow(弱阴离氧单核苷酸组成的,通常是以生物提取的脱氧核糖核酸子琼脂糖凝胶)购自GE公司。色谱柱XK26/20(直径(DNA)为原料,经5’2磷酸二酯酶
6、水解,并经过分离纯化得26mm)购自GE公司。层析仪AKTAprime购自GE。来的。5’2混合脱氧单核苷酸能够提供细胞和组织修复所必2方法需的核酸营养,参与体内核酸代谢过程。在临床上常用于治2.1鱼精DNA的纯度测定[7]疗由各种原因引起的白细胞减少症和血小板减少症、贫血及按李建武等方法进行。[123]再生障碍性贫血、各种炎症等多种疾病。2.2鱼精DNA的酶解5’2混合脱氧单核苷酸的工业生产中,影响质量和成本将鱼精DNA粉末(纯度为66.67%左右)用超纯水配成主要因素是分离纯化。目前工业上常采用201×7阴离子交1%的水溶液,90℃热变性10min,调p
7、H5.4,加1/6体积的核[3][4]换树脂或者201×8阴离子交换树脂进行,也有用D293酸酶P1溶液,酶活为168.63U/mL,在72℃水浴中保温酶解[5][6]大孔阴离子交换树脂的,还有报道用超滤法来进行纯化6h。的。这些方法虽然在工业上使用了几十年,但是存在一个共2.3769活性炭的预处理同的缺点:即重复性较差,生产中对经验的依赖性较强,质量用1mol/L的NaOH煮沸15min,超纯水洗至中性;再用缺乏稳定性。笔者试图利用GE公司的DEAESepharoseFast1mol/L的HCl煮沸15min,超纯水洗至pH3.0,备用。Flow层析凝胶,
8、建立一种快速高效的5’2混合脱氧单核苷酸2.4DNA
