AnnexinⅤPI法定量检测胎盘细胞凋亡

AnnexinⅤPI法定量检测胎盘细胞凋亡

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时间:2019-05-24

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1、AnnexinⅤ/PI法定量检测胎盘细胞凋亡【关键词】Annexin摘要目的:探讨AnnexinⅤ/PI法检测细胞凋亡较PI法的优越性。方法:三十份正常足月胎盘的滋养细胞标本同时进行AnnexinⅤ/PI法和PI法染色,经流式细胞仪检测分析细胞凋亡的百分数。结果:AnnexinⅤ/PI法和PI法检测的结果分别为3.71±1.86%、0.69±0.48%,二者有显著性差异(P<0.01)。结论:AnnexinⅤ/PI法可检测出细胞早期的凋亡,其灵敏、准确,是目前检测细胞凋亡较好的方法。关键词细胞凋亡(Apoptosis);AnnexinⅤ/P

2、I法;PI法;胎盘滋养细胞细胞凋亡一直是研究的热点,因其不仅可揭示某些疾病的发生、发展,亦可对治疗药物的选择,疗效的判断等方面提供有力的依据。目前常用的检测细胞凋亡的方法有检测DNA含量的PI(碘化丙啶)法和检测DNA断裂点的TUNEL法(terminaldeoxylnucleotidyltransferasemediated-dUTPnickendlabeling)。但二者的一致性较差,各有明显的优缺点。自1992年Fadok等[1]发现在细胞凋亡的早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)转移至细胞膜外侧,1995年Verems等[2]里

3、利用对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白(AnnexinⅤ)检测细胞凋亡,取得满意的结果,本文对比观察了使用AnnexinⅤ/PI法和直接PI法检测一组正常足月胎盘细胞的凋亡情况,现报告如下。1材料和方法1.1材料1.1.1观察对象正常足月胎盘组织30份,每份约2×2cm大小,立即送检。1.1.2试剂AnnexinⅤ/PI试剂盒,其中含有异硫氰酸荧光素(FITC)标记的AnnexinⅤ试剂,PI试剂,10倍浓缩的BindingBuffer液各一瓶,购于PHARMIGEN公司,PI试剂(自制,50ug/mlPI、2ug/mlRNA酶及终浓度为1%

4、Trion),PBS缓冲液(自制PH为7.4)。1.1.3仪器FAScan流式细胞仪(BD公司)。1.2实验方法1.2.1细胞悬液的制备胎盘组织剪成几小块,组织块间轻轻相互摩擦,生理盐水冲洗经200目尼龙网过滤,收集细胞悬液,用Percoll细胞分离液离心,收集界面细胞,PBS缓冲液洗涤两次(500~800转/分,5分钟/次),调整细胞为106/ml。1.2.2PI染色法取50ul制备的细胞悬液于测定管中加入100ul的自制的PI试剂,混匀,置冰箱孵育30分钟后上机分析G0/G1峰前的细胞即为凋亡细胞所占的百分比。1.2.3AnnexinⅤ

5、/PI染色法取100ul的细胞悬液于测定管中,加入5ul的FITC标记的AnnexinⅤ和2ul的PI,再加入300ul稀释后的BindingBuffer液,混匀,置室温暗处孵育30分钟后上机分析,分析AnnexinⅤ阳性而PI阴性的细胞的百分比。1.2.4数据处理以x±s%表达结果,t检验进行数据处理。2结果以PI法及AnnexinⅤ/PI联合染色法检测30例健康孕妇足月生产的胎盘组织滋养细胞的凋亡情况结果见表1,结果显示PI法检测的凋亡细胞数量明显小于AnnexinⅤ/PI联合法所得的结果,二者有显著性差异(P<0.01)。3讨论近年来

6、,细胞凋亡的研究从基础研究更多地转入临床应用的研究。表1PI法与AnnexinⅤ/PI法检测细胞凋亡的百分率(略)在对抗癌药物的选择,疾病的发生、发展机理及药理等诸多方面,取得了一定的成绩。常用的检测细胞凋亡的方法有PI染色法和TUNEL法,PI法是流式细胞术常用的定量检测细胞凋亡的方法,染料PI可穿透细胞膜与DNA结合,可在G0/G1期前出现一个亚二倍体的凋亡峰,根据凋亡峰的大小可定量检测出凋亡的细胞百分数。该法简便、快速、价廉,应用普遍,但无法区分死细胞,且细胞凋亡的早期尚未出现DNA片段大量丢失时,细胞的DNA不会出现在凋亡峰中,该法

7、不能检出,另外忽略了S期和G2/M期细胞的凋亡,结果的准确性受到质疑。而另一常用的TUNEL法是在TDT作用下将FITC标记的dUTP与DNA的断裂点3′-OH端上,根据FITC―dUTP渗透量来定量计算出凋亡细胞的量,此法可检出早期的细胞凋亡,具有高的灵敏性,但由于坏死细胞亦有DNA断裂点,亦可结合FITC―dUTP,该法同样无法区分死细胞,特异性降低[3]。当Vermes等[2]利用AnnexinⅤ结合PS检测细胞凋亡,取得满意结果后,将AnnexinⅤ和PI联合使用,区分了死细胞和凋亡细胞,提高了检测细胞凋亡的灵敏性和准确性。本文观察

8、的30例PI法的检测结果远低于AnnexinⅤ/PI联合法,细胞凋亡是一种发生在生理条件下的细胞死亡方式,使用PI法无法检出细胞的早期凋亡,不能真实的反映出细胞代谢的情况。据文献

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