AnnexinⅤPI法定量检测胎盘细胞凋亡

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1、AnnexinⅤ/PI法定量检测胎盘细胞凋亡【关键词】Annexin摘要目的:探讨AnnexinⅤ/PI法检测细胞凋亡较PI法的优越性。方法:三十份正常足月胎盘的滋养细胞标本同时进行AnnexinⅤ/PI法和PI法染色，经流式细胞仪检测分析细胞凋亡的百分数。结果:AnnexinⅤ/PI法和PI法检测的结果分别为3.71±1.86%、0.69±0.48%，二者有显著性差异（P<0.01）。结论:AnnexinⅤ/PI法可检测出细胞早期的凋亡，其灵敏、准确，是目前检测细胞凋亡较好的方法。关键词细胞凋亡（Apoptosis）;AnnexinⅤ/P

2、I法;PI法;胎盘滋养细胞细胞凋亡一直是研究的热点，因其不仅可揭示某些疾病的发生、发展，亦可对治疗药物的选择，疗效的判断等方面提供有力的依据。目前常用的检测细胞凋亡的方法有检测DNA含量的PI（碘化丙啶）法和检测DNA断裂点的TUNEL法（terminaldeoxylnucleotidyltransferasemediated-dUTPnickendlabeling）。但二者的一致性较差，各有明显的优缺点。自1992年Fadok等［1］发现在细胞凋亡的早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）转移至细胞膜外侧，1995年Verems等［2］里

3、利用对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白（AnnexinⅤ）检测细胞凋亡，取得满意的结果，本文对比观察了使用AnnexinⅤ/PI法和直接PI法检测一组正常足月胎盘细胞的凋亡情况，现报告如下。1材料和方法1.1材料1.1.1观察对象正常足月胎盘组织30份，每份约2×2cm大小，立即送检。1.1.2试剂AnnexinⅤ/PI试剂盒，其中含有异硫氰酸荧光素（FITC）标记的AnnexinⅤ试剂，PI试剂，10倍浓缩的BindingBuffer液各一瓶，购于PHARMIGEN公司，PI试剂（自制，50ug/mlPI、2ug/mlRNA酶及终浓度为1%

4、Trion），PBS缓冲液（自制PH为7.4）。1.1.3仪器FAScan流式细胞仪（BD公司）。1.2实验方法1.2.1细胞悬液的制备胎盘组织剪成几小块，组织块间轻轻相互摩擦，生理盐水冲洗经200目尼龙网过滤，收集细胞悬液，用Percoll细胞分离液离心，收集界面细胞，PBS缓冲液洗涤两次（500～800转/分，5分钟/次），调整细胞为106/ml。1.2.2PI染色法取50ul制备的细胞悬液于测定管中加入100ul的自制的PI试剂，混匀，置冰箱孵育30分钟后上机分析G0/G1峰前的细胞即为凋亡细胞所占的百分比。1.2.3AnnexinⅤ

5、/PI染色法取100ul的细胞悬液于测定管中，加入5ul的FITC标记的AnnexinⅤ和2ul的PI，再加入300ul稀释后的BindingBuffer液，混匀，置室温暗处孵育30分钟后上机分析，分析AnnexinⅤ阳性而PI阴性的细胞的百分比。1.2.4数据处理以x±s%表达结果，t检验进行数据处理。2结果以PI法及AnnexinⅤ/PI联合染色法检测30例健康孕妇足月生产的胎盘组织滋养细胞的凋亡情况结果见表1，结果显示PI法检测的凋亡细胞数量明显小于AnnexinⅤ/PI联合法所得的结果，二者有显著性差异（P<0.01）。3讨论近年来

6、，细胞凋亡的研究从基础研究更多地转入临床应用的研究。表1PI法与AnnexinⅤ/PI法检测细胞凋亡的百分率（略）在对抗癌药物的选择，疾病的发生、发展机理及药理等诸多方面，取得了一定的成绩。常用的检测细胞凋亡的方法有PI染色法和TUNEL法，PI法是流式细胞术常用的定量检测细胞凋亡的方法，染料PI可穿透细胞膜与DNA结合，可在G0/G1期前出现一个亚二倍体的凋亡峰，根据凋亡峰的大小可定量检测出凋亡的细胞百分数。该法简便、快速、价廉，应用普遍，但无法区分死细胞，且细胞凋亡的早期尚未出现DNA片段大量丢失时，细胞的DNA不会出现在凋亡峰中，该法

7、不能检出，另外忽略了S期和G2/M期细胞的凋亡，结果的准确性受到质疑。而另一常用的TUNEL法是在TDT作用下将FITC标记的dUTP与DNA的断裂点3′-OH端上，根据FITC―dUTP渗透量来定量计算出凋亡细胞的量，此法可检出早期的细胞凋亡，具有高的灵敏性，但由于坏死细胞亦有DNA断裂点，亦可结合FITC―dUTP，该法同样无法区分死细胞，特异性降低［3］。当Vermes等［2］利用AnnexinⅤ结合PS检测细胞凋亡，取得满意结果后，将AnnexinⅤ和PI联合使用，区分了死细胞和凋亡细胞，提高了检测细胞凋亡的灵敏性和准确性。本文观察

8、的30例PI法的检测结果远低于AnnexinⅤ/PI联合法，细胞凋亡是一种发生在生理条件下的细胞死亡方式，使用PI法无法检出细胞的早期凋亡，不能真实的反映出细胞代谢的情况。据文献