中国药品检验标准操作规范2010年版化学药部分128降钙素生物活性测定

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1、降钙素生物活性测定1实验材料用具1.1天平精度0.01mg供试品称量用精度1mg试剂称量用精度0.1g大鼠称重用1.2实验用具注射器（1ml，精度0.01ml）、吸管、移液管、带塞玻璃小瓶、带塞小离心管、烧杯、玻璃棒、量筒、容量瓶、脱脂棉、毛细管、记时器、离心机、分光光度计。1.3试剂氯化钠、牛血清白蛋白、浓盐酸、醋酸钠、血钙测定试剂盒。2溶液配制2.1溶剂的配制2.1.1牛血清白蛋白灭活称取牛血清白蛋白0.2g，加水20ml，混匀，置56℃水浴中保温1h，取出放至室温，于-10~-20℃温度下冻存。2.1.2上述溶液实验前取出，于36℃±0.5℃水浴中将其融化。2.1.3称取

2、2g醋酸钠置200ml容量瓶中，加入适量水使溶解，加入上述融化的牛血清白蛋白溶液，加入浓盐酸约3.5ml，再加水至总量近200ml，用盐酸或氢化钠溶液调节pH值至3.5~4.5，最后加水至200ml。2.2标准品溶液2.2.1取降钙素标准品，放置至室温。2.2.2割开安瓿（注意勿使内容物损失）立即用准确定量溶剂将降钙素标准品全部内容物洗出，按标示效价计算使成1.0IU/ml降钙素标准液，亦可精密加入适量溶剂使溶解，混合均匀，精密吸取适量，用溶剂配制成1.0IU/ml的标准品溶液。2.3标准品稀释2.3.1根据动物品系，来源，季节按中国药典附录降钙素生物检定法要求，选择标准品高、

3、低（dS2、dS1）2组剂量及其浓度之比值（r）剂距（r一般为3:1）。2.3.2计算2组剂量稀释液浓度及大鼠皮下注射所需总毫升数。2.3.3一般高浓度稀释液可配成每毫升中含0.1IU（随季节、动物品系和来源不同），低浓度稀释液可配成每毫升中含0.033IU，高、低两浓度比值r=3:1，给药量按100g体重计算，腹部皮下注射0.5ml/100g。高浓度稀释液dS2=0.1IU/ml×0.5ml/100g鼠×5.鼠/组=0.25IU/组，即0.1IU/ml高浓度稀释液2.5ml（按大鼠体重100g计算）低浓度稀释液dS1=0.033IU/ml×0.5ml/100g鼠×5.鼠/组=

4、0.0825IU/组，即0.033IU/ml高浓度稀释液2.5ml（按大鼠体重100g计算）2.3.4精密量取1.0IU/ml标准品溶液稀适量，置50ml烧杯中，加入溶剂释液成标准品dS2稀释液（如0.1IU/ml）。2.3.5同法用dS2标准品稀释液（如0.1IU/ml）配制成低浓度dS1溶液。2.4供试品溶液按降钙素供试品的标示效价或估计效价（AT）配制溶液。2.4.1粉末2.4.1.1取降钙素粉末，放置至室温。2.4.1.2迅速精密称取适量，置带塞玻璃瓶中。2.4.1.3将称量得毫克数，乘以标示单位数，得总单位数。2.4.1.4精确加溶剂配成1.0IU/ml溶液。2.4.

5、1.5精密量取上述溶液适量，加溶剂配成dT2（如0.1IU/ml）的供试品稀释液溶液。2.4.1.6同法用dT2标准品稀释液（如0.1IU/ml）配制成低浓度dT1溶液。2.4.2注射用粉针2.4.2.1取供试品放置至室温。2.4.2.2割开安瓿（注意勿使内容物损失）立即用定量的溶剂全部内容物洗出，使成1.0IU/ml溶液。2.4.2.3精密量取上述溶液适量，加溶剂配成dT2（如0.1IU/ml）的供试品溶液。2.4.2.4供试品dT1溶液同标准品dS1溶液的配制。3实验动物健康无伤，体重40~250g、同一性别、同一来源的大鼠。一次实验所用大鼠体重相差不超过20g。4检定法4

6、.1准备鼠盒，标明组别。4.2实验前禁食16h，自由饮用蒸馏水，实验当日按体重随机分成4组，每组至少5只。4.3将各组动物每只称重并编号。4.4分别按体重给各组动物于腹部皮下注射相应浓度的标准品或供试品2种浓度稀释液，给药体积为0.5ml/100g体重。4.5注射后每只立即用记时器准确记时1h，可每只间隔1~2min（视取血熟练程度定）。4.6按给药前后顺序分别自眼静脉丛取血。即刺破大鼠眼静脉丛，使血液滴入小离心管内，如取血清50μl，可取血0.5ml（10倍）。4.7静置1h后，3000r/min离心30min，分离血清。4.8用适宜的方法，如邻甲酚酞络合剂测定血清中的血钙值

7、；或按血钙测定试剂盒要求在分光光度计下测定吸收度，并作钙标准曲线，计算血清中的血钙值。5实验结果计算5.1从钙标准曲线的回归方程计算每只动物反应值（y）即血钙值。5.2将反应值按中国药典附录生物检定统计法列表的格式整理。5.3按量反应平行线测定（2.2）法或（2.2.2）法随机设计处理结束。5.3.1进行可靠性测试，实验结果成立者，进行以下计算。5.3.2计算M、RT、PT、Sm、FL、FL%。5.3.3以上计算也可编制程序，用计算机计算。5.4实验结果中出现的特大、特小等特异反应值，按《中