GB15193.5-94 骨髓微核试验.pdf

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1、中华人民共和国国家标准GB15193.5一94骨髓微核试验Micronucleustestofhonemarrowcell1主题内容与适用范围本标准规定了微核试验的基本技术要求。本标准适用于检测环境有害物质的致突变作用2原理微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。这种情况的出现往往是由于受到染色体断裂剂作用的结果。另外，也可能在受到纺睡体毒物的作用时，主核没有能够形成.代之以一组小核。此时小核往

2、往比一般典型的微核稍大。3试剂和材料全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为蒸馏水。3.，小牛血清小牛血清滤菌后放入56℃恒温水浴保温1h进行灭活。通常储存于4℃冰箱冰盒里。亦可用大、小鼠血清代替。3.2Giemsa染液称取Giemsa染料3.8g，加入375mL甲醇(分析纯)研磨，待完全溶解后，再加人125mL甘油。置37C恒温箱保温48h振摇数次。过滤两周后用。3.3Giemsa应用液取1份Giemsa染液与6份磷酸盐缓冲液棍合而成。临用时配制。3,41115mo11L磷酸盐缓冲液(Fl-1S.8)磷酸二氢钾(KH,PO,)4.50g磷酸氢二钠(Na,HPO,·1

3、2H,O)11.81g加蒸馏水至1000ml,I5甲醇(分析纯)。3.6解剖器械，生物显微镜，载玻片等。4实验动物小白鼠是微核试验的常规动物，也可选用大白鼠。通常用7^12周龄，体重25^30g的小鼠或体重150^-200g的大鼠。每组用两种性别的动物至少各5只。中华人民共和国卫生部1994一08一10批准1994一08一10实施.www.bzxzk.com.GB15193.5一945荆t分组原则上以动物出现严重中毒症状和/或个别动物出现死亡为最高剂量。一般可取1/21,D_急性毒性受试物最大给予量无死亡时，则以受试物最大给予量或59/kg体重为最高剂量.以下设3一5

4、个剂量组。另设溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照物可用环磷酞胺40mg/kg体重经n给予。6操作步骤6.1标本制备经口灌胃。根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，定取材时间。常用30h给受试物法。即两次给受试物间隔24h,第二次给受试物后6h.颈椎脱臼处死动物。取胸骨或股骨，用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规徐片。或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片，涂片自然干燥后放入甲醇中固定5-10min。当日固定后保存。将固定好的涂片放人Giemsa应用液中，染色10^-15min。立即用pH6.8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗。晾干。写好标签，干燥器中保

5、存。62阅片选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，在油镜下观察。以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。本法系观察嗜多染红细胞的微核。用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞皇粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/2。一1/5a用双盲法阅片。每只动物计数100。个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示。观察嗜多染红细胞与成熟红细胞(PCE/RBC)，可作为细胞毒性指标之一。一般计数200个嗜多染红细胞。了数据处理一般采用卡方检验、泊松分布、或双侧!检验等统计

6、方法进行数据处理，并按动物性别分别统计。8结果评价试验组与对照组相比，试验结果微核率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上有显著性差别，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。附加说明:本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由卫生部食品卫生监督检验所、中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、浙江省卫生防疫站负责起草。本标准主要起草人徐凤丹、韩驰、赵硕。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。.www.bzxzk.com.